藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬骨骼肌差異表達(dá)cis-NATs基因鑒定

許月園，齊曉龍，候曄，趙云霞，欒宇，周煥煥，趙書紅,2，李新云,2,3

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藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬骨骼肌差異表達(dá)-NATs基因鑒定

許月園1，齊曉龍1，候曄1，趙云霞1，欒宇1，周煥煥1，趙書紅1,2，李新云1,2,3

（1華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070；3農(nóng)業(yè)部豬健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西揚(yáng)翔股份有限公司，廣西貴港 537100）

【目的】通過(guò)分析藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中品種間骨骼肌組織差異表達(dá)基因及順式天然反義轉(zhuǎn)錄本（-natural antisense transcripts,-NATs），并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行整合分析，探索-NATs調(diào)控豬骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)理?！痉椒ā渴褂貌町惐磉_(dá)分析鑒定藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬胚胎期35 d至出生后180 d共10個(gè)時(shí)間點(diǎn)品種間差異表達(dá)基因及-NATs（|log2FC|≥1且 FDR＜0.01）；然后通過(guò)功能富集分析注釋出差異表達(dá)基因及-NATs對(duì)應(yīng)的正義基因主要參與的GO生物學(xué)過(guò)程（＜0.01）及KEGG通路(＜0.05)；再根據(jù)與-NATs相關(guān)表達(dá)的基因數(shù)目篩選出-NATs主要參與的GO生物學(xué)過(guò)程和KEGG通路，并根據(jù)通路間的相同基因數(shù)目對(duì)所有KEGG通路進(jìn)行整合；最后基于通路內(nèi)-NATs及其正義基因在品種間的差異表達(dá)倍數(shù)進(jìn)行通路可視化分析。【結(jié)果】在藍(lán)塘和長(zhǎng)白豬骨骼肌發(fā)育的10個(gè)時(shí)間點(diǎn)共鑒定出5 350個(gè)品種間差異表達(dá)基因和738個(gè)差異表達(dá)-NATs；GO分析結(jié)果顯示品種間骨骼肌組織差異表達(dá)-NATs主要與肌肉發(fā)育及能量代謝等GO生物學(xué)過(guò)程中的基因相關(guān)表達(dá)；KEGG通路整合分析發(fā)現(xiàn)能量代謝通路之間關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)；其中線粒體三羧酸循環(huán)通路中基因及其相關(guān)表達(dá)的-NATs在仔豬出生后早期表達(dá)量較高；通路可視化分析發(fā)現(xiàn)在肌纖維生長(zhǎng)的兩個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)即胚胎期49 d和77 d，藍(lán)塘豬能量代謝相關(guān)通路中基因及其相關(guān)表達(dá)的-NATs顯著高表達(dá)于長(zhǎng)白豬，而出生后品種間表達(dá)模式的變化則主要集中在出生后2—90 d的出生后早期階段?！窘Y(jié)論】在藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬骨骼肌發(fā)育的10個(gè)時(shí)間點(diǎn)，共鑒定出738個(gè)品種間差異表達(dá)的NATs，功能注釋結(jié)果表明這些-NATs主要通過(guò)與能量代謝通路中的基因相關(guān)表達(dá)從而參與影響藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬品種間骨骼肌纖維發(fā)育差異。

藍(lán)塘豬；長(zhǎng)白豬；順勢(shì)天然反義轉(zhuǎn)錄本；差異表達(dá)；能量代謝

0 引言

【研究意義】天然反義轉(zhuǎn)錄本（natural antisense transcripts，NATs）是一類內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄的可以與其他RNA轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)配對(duì)的RNA[1]，它既可以是編碼蛋白的RNA，也可以是非編碼的RNA。NATs根據(jù)其轉(zhuǎn)錄來(lái)源可以分為順式NATs（-NATs）和反式NATs（trans-NATs）[2]。-NATs轉(zhuǎn)錄自基因的互補(bǔ)鏈而trans-NATs從基因組其他位置轉(zhuǎn)錄。研究表明NATs在人、鼠、豬、酵母和擬南芥等真核生物組織中均廣泛存在[3-4]。由此可見-NATs是基因表達(dá)調(diào)控的重要因素，本研究的意義在于通過(guò)對(duì)不同品種豬背最長(zhǎng)肌組織中-NATs的研究進(jìn)一步解析豬骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)理?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】骨骼肌占哺乳動(dòng)物總體重的50%左右[5]。研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌發(fā)育過(guò)程中的多個(gè)關(guān)鍵基因都存在-NATs。Braunschweig等研究指出與其-NATs在豬的肌肉組織中協(xié)同表達(dá)[6]。Sun等在豬的肌肉和肝臟等多個(gè)組織中均檢測(cè)到了的天然反義轉(zhuǎn)錄基因，在肌纖維的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中兩者呈相反表達(dá)[7]。Pandorf等發(fā)現(xiàn)大鼠MHC基因簇的-NATs分別與1和2協(xié)同表達(dá)和相反表達(dá)[8]，從而影響骨骼肌的肌纖維類型。Chen等在全基因組水平上對(duì)豬的-NATs進(jìn)行了研究，該研究表明豬骨骼肌中約30%的轉(zhuǎn)錄本具有-NATs[4]。NATs主要參與其正義基因轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，目前已報(bào)道的調(diào)控機(jī)制主要包括：轉(zhuǎn)錄干擾[9]、RNA封閉[10]、RNA編輯[11]、RNA干擾[12]、染色質(zhì)重塑[13-14]和兼并異染色質(zhì)機(jī)制[15]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】豬骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育與其生長(zhǎng)速度和瘦肉率息息相關(guān)，直接關(guān)系著生豬養(yǎng)殖的生產(chǎn)效益。中外豬種在生長(zhǎng)速度和瘦肉率性狀上具有明顯的遺傳差異，長(zhǎng)白豬作為高度選育的瘦肉型外國(guó)豬種，具有生長(zhǎng)快，瘦肉率高等特點(diǎn)，而中國(guó)地方豬種藍(lán)塘豬的胴體瘦肉率相對(duì)較低，生長(zhǎng)速度也相對(duì)較慢[16]。因此，以藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬作為試驗(yàn)對(duì)象來(lái)探索-NATs與不同豬品種骨骼肌發(fā)育差異的關(guān)系，有助于進(jìn)一步了解瘦肉型豬和肥胖型豬之間骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育遺傳差異的分子機(jī)制。雖然多項(xiàng)研究成果表明-NATs廣泛存在于豬的骨骼肌中，但是-NATs在中外豬種骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中是否存在差異以及其所參與的生物學(xué)過(guò)程和代謝通路仍有待于研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】運(yùn)用生物信息學(xué)分析手段，系統(tǒng)比較多個(gè)時(shí)間點(diǎn)藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬骨骼肌組織中差異表達(dá)-NATs，并以此為基礎(chǔ)利用- NATs與相關(guān)表達(dá)的正義基因進(jìn)行功能聚類分析，探索-NATs參與藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中品種間骨骼肌發(fā)育差異的分子機(jī)理。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年5—8月在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)中表達(dá)譜及-NATs數(shù)據(jù)[17-18]來(lái)自于筆者已發(fā)表的長(zhǎng)白豬和藍(lán)塘豬的背最長(zhǎng)肌組織基因表達(dá)譜及-NATs表達(dá)譜數(shù)據(jù)。該套數(shù)據(jù)共有10個(gè)發(fā)育時(shí)期，分別為胚胎期35 d、胚胎期49 d、胚胎期63 d、胚胎期77 d、胚胎期91 d、生后期2 d、生后期28 d、生后期90 d、生后期120 d及生后期180 d。本研究基于本實(shí)驗(yàn)室前期已發(fā)表的已注釋基因表達(dá)、-NATs表達(dá)及相關(guān)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步探索了品種間基因表達(dá)及-NATs差異及相關(guān)功能。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 差異表達(dá)分析 本研究使用edger R語(yǔ)言包[19]鑒定藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬兩品種間差異表達(dá)的-NATs及基因，差異表達(dá)的閾值為|log2FC|≥1且FDR＜0.01。

1.2.2 功能注釋分析 為了解析兩品種間差異表達(dá)-NATs的生物學(xué)功能，我們首先運(yùn)用DAVID[20]對(duì)兩品種的差異表達(dá)基因及差異表達(dá)-NATs對(duì)應(yīng)的正義基因進(jìn)行了GO分析和KEGG分析。篩選GO生物學(xué)過(guò)程和KEGG通路的閾值分別為＜0.01和＜0.05。然后，利用-NATs與其對(duì)應(yīng)的正義基因表達(dá)相關(guān)（|R|＞0.70且FDR＜0.05）進(jìn)一步篩選-NATs顯著富集（-NATs個(gè)數(shù)大于10個(gè)）的GO生物學(xué)過(guò)程。同時(shí)，運(yùn)用Cytoscape[21]對(duì)顯著富集的KEGG通路（＜0.05）進(jìn)行整合分析，根據(jù)每個(gè)通路所包含的有相關(guān)表達(dá)的-NATs的基因數(shù)目填充節(jié)點(diǎn)顏色，以通路間共有的基因數(shù)目填充線的寬度，最后結(jié)合節(jié)點(diǎn)的顏色和線的寬度將代謝通路進(jìn)行歸類。

1.2.3 通路可視化分析 根據(jù) KEGG通路整合分析對(duì)聯(lián)系最緊密的模塊進(jìn)行了通路可視化分析，并用Cystoscape軟件進(jìn)行了繪圖。首先，過(guò)濾掉通路中沒(méi)有表達(dá)量的基因節(jié)點(diǎn)；然后根據(jù)各通路間的連接節(jié)點(diǎn)合并通路；進(jìn)一步根據(jù)表達(dá)相關(guān)添加-NATs節(jié)點(diǎn)；用表達(dá)差異倍數(shù)填充節(jié)點(diǎn)顏色。

2 結(jié)果

2.1 豬骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中共有5 350個(gè)基因和738個(gè)cis-NATs在藍(lán)塘豬與長(zhǎng)白豬兩品種間差異表達(dá)

根據(jù)10個(gè)時(shí)間點(diǎn)豬骨骼肌組織基因和-NATs表達(dá)譜，在藍(lán)塘豬與長(zhǎng)白豬兩品種間進(jìn)行差異表達(dá)分析，共鑒定出5 350個(gè)差異表達(dá)基因和738個(gè)差異表達(dá)-NATs（| log2FC |≥1，F(xiàn)DR＜0.01）。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)基因及-NATs數(shù)目如表1所示；出生后早期2—90 d，藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬之間的差異表達(dá)基因及-NATs數(shù)目相對(duì)出生前明顯下降（表1）；MAplot顯示品種間-NATs差異表達(dá)倍數(shù)分布類似于正義基因的差異表達(dá)倍數(shù)分布（圖1）。各時(shí)間點(diǎn)差異倍數(shù)前十（5個(gè)藍(lán)塘豬上調(diào)表達(dá)和5個(gè)藍(lán)塘豬下調(diào)表達(dá)）的差異表達(dá)基因及-NATs如表2所示。

圖1 藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬差異表達(dá)基因及差異表達(dá)cis-NATs MAplot圖

2.2 品種間骨骼肌組織差異表達(dá)cis-NATs主要富集在骨骼肌發(fā)育及能量代謝的GO生物學(xué)過(guò)程中

利用DAVID功能注釋平臺(tái)對(duì)差異表達(dá)-NATs及相關(guān)正義基因進(jìn)行功能注釋分析，結(jié)合表達(dá)相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)包含10個(gè)以上差異表達(dá)-NATs的正義基因的GO生物學(xué)過(guò)程有兩類，第一類是肌肉發(fā)育，包含肌肉收縮（muscle contraction）、肌肉器官發(fā)育（muscle organ development）、骨骼肌細(xì)胞分化（skeletal muscle cell differentiation）和橫紋肌收縮（striated muscle contraction）等11個(gè)GO生物學(xué)過(guò)程；第二類是能量代謝，主要包括糖酵解過(guò)程（glycolytic process）、糖異生（gluconeogenesis）、氫離子跨膜運(yùn)輸（hydrogen ion transmembrane transport）和ATP生物合成過(guò)程（ATP biosynthetic process）等6個(gè)GO生物學(xué)過(guò)程（表3）。

表1 藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬差異表達(dá)基因及差異表達(dá)cis-NATs數(shù)目統(tǒng)計(jì)

表2 骨骼肌發(fā)育過(guò)程中藍(lán)塘豬與長(zhǎng)白豬排在前10的差異表達(dá)基因及cis-NATs

2.3 KEGG通路整合分析發(fā)現(xiàn)能量代謝通路之間關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)

利用Cytoscape軟件根據(jù)KEGG通路間相同基因的數(shù)目進(jìn)行歸類，最終將通路分為三大類：能量代謝相關(guān)通路、肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)通路及其他。其中能量代謝相關(guān)通路包括糖酵解/糖異生、三羧酸循環(huán)及氧化磷酸化等，肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的通路則有心肌收縮、肥厚性心肌病及擴(kuò)張型心肌病等（圖2）。進(jìn)一步分析顯示能量代謝相關(guān)的通路之間相同數(shù)目基因較多，關(guān)系更緊密。

2.4 線粒體中三羧酸循環(huán)通路的cis-NATs及基因在仔豬出生后早期表達(dá)量更高

根據(jù)通路整合結(jié)果篩選出線粒體中三羧酸循環(huán)代謝通路的差異表達(dá)基因及其相關(guān)表達(dá)的-NATs，利用perl語(yǔ)言提取這些基因在長(zhǎng)白豬和藍(lán)塘豬10個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量，使用R語(yǔ)言pheatmap包繪制熱圖（圖3）。在胚胎期，藍(lán)塘豬的線粒體中三羧酸循環(huán)通路的基因及-NATs表達(dá)量整體稍高于長(zhǎng)白豬。仔豬出生后，基因及-NATs的表達(dá)量顯著上升。在出生后2 d，長(zhǎng)白豬的表達(dá)量普遍高于藍(lán)塘豬。到第28天時(shí)大部分基因及-NATs表達(dá)量出現(xiàn)反轉(zhuǎn)，藍(lán)塘豬的表達(dá)量更高。在第90天時(shí)，藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬的表達(dá)量都有所下降。第120天和180天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差別不大，整體上都是藍(lán)塘豬稍高于長(zhǎng)白豬。

表3 包含10個(gè)以上差異表達(dá)cis-NATs的GO生物學(xué)過(guò)程

F代表胚胎期，P代表生后期 F means fetal stage, and P indicates postnatal stage

節(jié)點(diǎn)顏色的深淺代表通路中包含有相關(guān)表達(dá)的cis-NATs的基因數(shù)目；線的寬度代表節(jié)點(diǎn)間所含相同基因的數(shù)目；有相關(guān)表達(dá)的cis-NATs的基因數(shù)目小于3的通路用“”表示；其余則用“”表示

LD代表長(zhǎng)白豬；LT代表藍(lán)塘豬 LD means Landrace and LT means Lantang

2.5 通路可視化分析發(fā)現(xiàn)cis-NATs在品種間的差異表達(dá)具有時(shí)效性

根據(jù)不同KEGG通路之間的節(jié)點(diǎn)基因合并能量代謝相關(guān)通路，結(jié)合通路中的基因和-NATs的表達(dá)量以及兩者在中外豬種間的差異表達(dá)倍數(shù)，繪制出生后不同時(shí)期的能量代謝通路。在胚胎期第49天和胚胎期第77天藍(lán)塘豬的基因及-NATs的表達(dá)量顯著高于長(zhǎng)白豬，其中，胚胎期第49天藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬能量代謝通路中相關(guān)基因及其-NATs的差異表達(dá)情況如圖4-A所示。仔豬出生后第2天，藍(lán)塘豬與能量代謝相關(guān)的通路中基因及-NATs的表達(dá)量顯著低于長(zhǎng)白豬（圖4-B）。生后期28 d，藍(lán)塘豬的表達(dá)量明顯上升，大部分基因及-NATs的表達(dá)量高于長(zhǎng)白豬（圖5-A），而生后期90 d，藍(lán)塘豬糖酵解通路及氧化磷酸化通路中基因及-NATs的表達(dá)量相對(duì)于長(zhǎng)白豬顯著下調(diào)（圖5-B）。圖4和圖5說(shuō)明-NATs在品種間的差異表達(dá)具有時(shí)效性，不同時(shí)間點(diǎn)上藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬的差異表達(dá)情況有所不同。

3 討論

3.1 cis-NATs差異表達(dá)分析

目前關(guān)于骨骼肌中-NATs的研究主要集中于鑒定、發(fā)育過(guò)程中表達(dá)模式及與其正義基因間表達(dá)關(guān)系等方面，不同豬種-NATs表達(dá)模式的比較卻鮮有研究。因此品種間-NATs的差異表達(dá)模式是否影響豬骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程仍有待于研究。長(zhǎng)白豬和藍(lán)塘豬在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育方面存在較大差異，前人研究發(fā)現(xiàn)兩品種間肌纖維數(shù)目及橫截面積都存在差異[17, 22]，中外豬種肌纖維類型也有較大差異[23]。本研究通過(guò)對(duì)胚胎期至成年共10個(gè)時(shí)間點(diǎn)的長(zhǎng)白豬和藍(lán)塘豬骨骼肌組織中差異表達(dá)的-NATs進(jìn)行分析，總共鑒定出738個(gè)差異表達(dá)-NATs。為了研究這些-NATs的生物學(xué)功能，本研究首先對(duì)差異表達(dá)的基因及-NATs對(duì)應(yīng)的基因進(jìn)行了功能聚類分析，并在此基礎(chǔ)上篩選出包含有顯著相關(guān)表達(dá)的-NATs的正義基因顯著富集的GO生物學(xué)過(guò)程和KEGG通路，以此來(lái)推斷豬骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬間差異表達(dá)-NATs參與的主要通路，解析-NATs調(diào)控品種間骨骼肌發(fā)育差異的分子機(jī)理。

3.2 功能注釋及通路可視化

GO分析結(jié)果顯示，藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬的差異表達(dá)基因及其相關(guān)表達(dá)的-NATs富集在與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育及能量代謝相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程中。由于能量代謝相關(guān)KEGG通路之間的關(guān)聯(lián)性更為緊密（圖2），因此本研究對(duì)藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬之間能量代謝相關(guān)通路進(jìn)行了進(jìn)一步的比較及可視化分析。能量代謝通路可視化分析結(jié)果顯示：胚胎期49 d和77 d時(shí)藍(lán)塘豬的-NATs的表達(dá)量顯著高于長(zhǎng)白豬（圖4-A）。已有研究顯示豬在出生前肌纖維數(shù)量已經(jīng)基本確定[24]，胚胎期第49和77天分別處于豬初級(jí)肌管和次級(jí)肌管增殖的高峰期內(nèi)，初級(jí)肌管和次級(jí)肌管分別發(fā)育成為初級(jí)肌纖維和次級(jí)肌纖維，研究表明長(zhǎng)白豬的次級(jí)肌纖維數(shù)目多于藍(lán)塘豬，長(zhǎng)白豬在胚胎期生肌速度更快[17]，這暗示-NATs可能參與豬胚胎期肌纖維的生長(zhǎng)調(diào)控。此外，本研究統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：與能量代謝相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程中差異表達(dá)的-NATs主要富集在生后期而胚胎期較少（表3），且三羧酸循環(huán)通路中的基因及-NATs在藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬的生后期表達(dá)量也都顯著高于胚胎期（圖3），這可能與仔豬在出生后能量代謝較為旺盛有關(guān)。

豬在出生后骨骼肌發(fā)育主要是肌纖維類型的轉(zhuǎn)變，肌纖維根據(jù)收縮功能和所含酶系及活性可以劃分為四種類型：慢收縮氧化型（I型）、快收縮氧化型（IIa型）、中間型（IIx型）和快收縮酵解型（IIb型）[25]。I型肌纖維富含線粒體，有氧代謝的酶系活性很高，主要通過(guò)有氧代謝供能，纖維細(xì)小、收縮慢而持久；IIb型肌纖維含少量線粒體，糖酵解酶系和ATP酶活性較高，主要進(jìn)行厭氧代謝，纖維粗大、收縮快但不持久；IIa型和IIx型肌纖維的特征介于I 型和IIb型之間[26]。剛出生的仔豬肌纖維類型是氧化型，有氧代謝占主導(dǎo)[27]。豬骨骼肌肌纖維類型的分化主要發(fā)生在出生后早期，從出生開始部分氧化型（I型）肌纖維逐漸轉(zhuǎn)化成酵解型（II型）肌纖維，即I型肌纖維數(shù)目開始下降，II型肌纖維開始出現(xiàn)并逐漸增加[28]。在出生后早期這一轉(zhuǎn)化就會(huì)完成，且肌纖維類型比例基本確定[29-31]。本研究發(fā)現(xiàn)在出生后早期，藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬的差異表達(dá)模式在28 d和90 d發(fā)生了兩次轉(zhuǎn)變：在生后期2 d，藍(lán)塘豬與能量代謝相關(guān)的通路中基因及其相關(guān)表達(dá)的-NATs的表達(dá)量顯著低于長(zhǎng)白豬（圖4-B），到生后期28 d發(fā)生轉(zhuǎn)變（圖5-A）。而生后期90 d時(shí)再次發(fā)生反轉(zhuǎn)，與生后期2 d類似，藍(lán)塘豬的能量代謝相關(guān)通路中基因及其相關(guān)表達(dá)的-NATs相對(duì)于長(zhǎng)白豬顯著下調(diào)（圖5-B）。研究表明長(zhǎng)白豬較中國(guó)地方豬種擁有更多的酵解型肌纖維[23]。與本研究相對(duì)應(yīng)的發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的研究表明，長(zhǎng)白豬能量代謝相關(guān)通路中的基因及其相關(guān)表達(dá)的-NATs在生后期2 d到28 d間發(fā)生劇烈下調(diào)并一直持續(xù)到90 d，而藍(lán)塘豬類似的下調(diào)則晚于長(zhǎng)白豬[18]。這表明長(zhǎng)白豬的肌纖維類型轉(zhuǎn)化可能早于藍(lán)塘豬，并且這種差異與品種間差異表達(dá)的-NATs相關(guān)。因此推測(cè)藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬出生后NATs的差異表達(dá)與兩品種豬肌纖維類型的轉(zhuǎn)變調(diào)控相關(guān)。

A. 胚胎期49 d時(shí)藍(lán)塘豬長(zhǎng)白豬的對(duì)比Fetal 49 day LT vs. LD；B. 生后期2 d時(shí)藍(lán)塘豬與長(zhǎng)白豬的對(duì)比Postnatal 2 day LT vs. LD

A．生后期28 d時(shí)藍(lán)塘豬與長(zhǎng)白豬的對(duì)比Postnatal 28 day LT vs. LD；B．生后期90 d時(shí)藍(lán)塘豬與長(zhǎng)白豬的對(duì)比Postnatal 90 day LT vs. LD

4 結(jié)論

在藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬兩品種背最長(zhǎng)肌中總共篩選了5 350個(gè)差異表達(dá)基因和738個(gè)差異表達(dá)-NATs。功能分析結(jié)果表明品種間差異表達(dá)基因及-NATs主要富集到與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育和能量代謝相關(guān)的通路中。通過(guò)可視化分析結(jié)果顯示-NATs參與豬骨骼肌組織中能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控，這可能是導(dǎo)致品種間骨骼肌纖維數(shù)目及類型差異的原因之一。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Comparison Study of Differential Expression Genesand-NATs of Skeletal Muscle Between Lantang and Landrace Pig

XU Yueyuan1, QI Xiaolong1, HOU Ye1, ZHAO Yunxia1, LUAN Yu1, ZHOU Huanhuan1, ZHAO Shuhong1,2, LI Xinyun1,2,3

（1Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics, Breeding and Reproduction (Huazhong Agricultural University), Ministry of Education, Wuhan 430070;2The Cooperative Innovation Center for Sustainable Pig Production,Wuhan 430070;3Key Laboratory of Pig Healthy Breeding, Ministry of Agriculture, Guangxi Yangxiang Co Ltd, Guigang 537100, Guangxi）

【Objective】 This study was designed to analyze the molecular mechanism of pig skeletal muscle development regulated by-natural antisense transcripts (-NATs) by comparing the differential expression genes and-NATs between Lantang and Landrace pig during their skeletal muscle development. 【Method】In this study, the following steps were adopted: (i) The differential expression genes (DEGs) and-NATs comparing Lantang (LT) and Landrace (LR) pig breeds at 10 time-points distributed from 35 days-post-coitus (dpc) to 180 days-post-natum (dpn) were identified (|log2FC|＞1 and FDR＜0.01). (ii) The significant biological process Gene Ontology (GO) terms (＜0.01) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathways (＜0.05) of the DEGs and the sense gene of differential expression-NATs were enriched via function enrichment analysis. (iii) Then the significant biological process GO terms and KEGG pathways that-NATS participated were filtered by the number of related genes of-NATs, and KEGG pathways were integrated by the number of same genes between pathways. Finally, visual analyses was conducted based on fold change of differential expression-NATs and their sense gene between breeds within pathways.【Result】A total of 5 350 DEGs and 738 differential expression-NATs were identified between LT and LR at 10 time points in this study. GO analysis showed that the expression of differential expression-NATs between LT and LR in skeletal muscle was primarily concerned with genes in biological process, including muscle development and energy metabolism. The integrated analysis of KEGG pathways found that energy metabolism pathways were strongly related by DE genes and their correlated-NATs. Moreover the expression of genes and their correlated-NATs were higher in pig mitochondrial citrate cycle pathway during early stages of birth than adulthood. The visual analyses of KEGG pathways showed that the expression level of energy metabolism pathway involved genes and their correlated-NATs were higher in LT than LR at 49 dpc and 77 dpc, which were two critical points for muscle fibers growth. The differences of expression patterns between LT and LR primarily appear at the early postnatal stages of 2 dpn-90 dpn. 【Conclusion】In this study, 738 differential expression-NATs were identified by comparing between LT and LR at 10 time points of skeletal muscle development. Function enrichment analysis showed that-NATs played a role in developmental differences of skeletal muscle fibers between LT and LR by interacting with genes expressed in energy metabolism related pathways.

Lantang; Landrace; cis-natural antisense transcripts; differential expression; energy metabolism

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.016

2017-09-01；

2018-02-02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31672391，31601920）、國(guó)家“863”項(xiàng)目（2013AA102502）

許月園，E-mail：yyxu@webmail.hzau.edu.cn。

李新云，E-mail：xyli@mail.hzau.edu.cn