基于液質(zhì)聯(lián)用法同時檢測龜甲膠飲片中牛皮源、驢皮源及龜甲膠成分

郝剛，羅丹，鐘水生

（1.蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測研究中心，江蘇 蘇州 215104；2.浙江省人民醫(yī)院藥學(xué)部，浙江 杭州 310014）

龜甲膠作為常見的膠類藥材，具有滋陰、養(yǎng)血、止血等功效，常用于陰虛潮熱、骨蒸盜汗、腰膝酸軟、血虛萎黃、崩漏帶下等癥狀[1]。龜甲來源主要為龜科動物烏龜（Chinemys reevesii）的背甲及腹甲，然而目前市場上龜甲膠質(zhì)量參差不齊，某些非法生產(chǎn)企業(yè)為追求經(jīng)濟(jì)效益，采用牛皮、驢皮等其他動物皮類制成龜甲膠，不僅為人民群眾安全用藥帶來危害，也為傳統(tǒng)藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提出挑戰(zhàn)[2-6]。本實(shí)驗(yàn)基于超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-MS/MS）建立了同時檢測龜甲膠飲片中牛皮源、驢皮源及龜甲膠等成分的測定方法，實(shí)現(xiàn)龜甲膠飲片中主成分鑒別與非法添加成分檢查的同時測定。

1 材料

1.1 儀器

Waters公司超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜（儀器型號：ACQUITY Xevo TQ-S）；電噴霧離子源（ESI＋），Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；KQ-300DA型數(shù)控型超聲波清洗器；Thermo低溫離心機(jī)；MILLIPORE純水儀。

1.2 樣品與試劑

龜甲膠對照藥材（批號：121693-201301），黃明膠對照藥材（批號：121695-201301）， 阿膠對照藥材（批號：121274-201202）均購自中國食品藥品檢定研究院；序列分析級胰蛋白酶購自Sigma-Aldrich公司（批號規(guī)格：T1426-50 mg）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其他試劑均為色譜純。供試品龜甲膠飲片均來源于市場監(jiān)督抽樣。

2 方法與結(jié)果

2.1 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描；毛細(xì)管電壓3.0 kV；毛細(xì)管溫度：200℃；脫溶劑氣體流量：500 L/h；錐孔氣流量：150 L/h；氬氣為碰撞氣；采用多反應(yīng)檢測模式（MRM）監(jiān)測，以質(zhì)荷比（m/z）631.3（雙電荷）→546.4和（m/z）631.3（雙電荷）→921.4作為龜甲膠特征肽段離子對；（m/z）641.3（雙電荷）→726.2和（m/z）641.3（雙電荷）→783.3作為牛皮源特征肽離子對；（m/z）539.8（雙電荷）→612.4和（m/z）539.8（雙電荷）→924.0作為驢皮源特征肽離子對。

2.2 色譜條件

BEH-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：以乙腈為流動相A，0.1%甲酸溶液為流動相B，按表1方法進(jìn)行梯度洗脫；柱溫：20℃；進(jìn)樣器溫度：15℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.3 溶液制備

龜甲膠、黃明膠、阿膠對照藥材溶液制備：分別取龜甲膠、黃明膠、阿膠對照藥材0.1 g，置于50 mL容量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液超聲溶解并稀釋至刻度。混合對照溶液制備：分別取黃明膠對照藥材溶液、阿膠對照藥材溶液5 mL，置100 mL容量瓶中，加龜甲膠對照藥材溶液稀釋至刻度，過0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液100 μL，加胰蛋白酶溶液10 μL（取序列分析級胰蛋白酶，加1%碳酸氫銨溶液制成1 mg/mL的溶液，臨用新配），搖勻，37℃恒溫酶解12 h，進(jìn)樣分析。

供試品溶液制備：取龜甲膠飲片打粉，精密稱定粉末0.1 g，置于50 mL容量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液超聲溶解并稀釋至刻度，過0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液100 μL，加胰蛋白酶溶液10 μL，搖勻，37℃恒溫酶解12 h，進(jìn)樣分析。

2.4 方法專屬性

按上述質(zhì)譜方法和色譜條件檢測龜甲膠、黃明膠、阿膠混合對照溶液，MRM質(zhì)譜如圖1所示，黃明膠對照品藥材保留時間為3.6 min，阿膠對照藥材保留時間為6.03 min，龜甲膠對照藥材保留時間為8.24 min?？瞻谆|(zhì)溶液如圖2所示，結(jié)果表明，空白基質(zhì)溶液在龜甲膠、黃明膠、阿膠保留時間處無干擾。

圖1 黃明膠、阿膠、龜甲膠對照藥材溶液特征離子色譜圖

圖2 空白基質(zhì)溶液色譜圖

龜甲膠（圖3）、阿膠（圖4）、黃明膠（圖5）對照品藥材溶液分別進(jìn)樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在所建方法中，任一對照藥材對其他2種對照藥材的檢測均無干擾，3種對照藥材的特征肽離子對專屬性良好。

圖3 龜甲膠對照藥材溶液特征離子色譜圖

圖4 阿膠對照藥材溶液特征離子色譜圖

圖5 黃明膠對照藥材溶液特征離子色譜圖

2.5 檢測限

龜甲膠、黃明膠、阿膠對照藥材溶液逐級稀釋，以各自特征肽離子對色譜圖信噪比3∶1計(jì)算檢測限，結(jié)果表明，龜甲膠檢測限濃度為0.5 mg/L，黃明膠檢測限濃度為2.0 mg/L，阿膠檢測限濃度為1.0 mg/L。

2.6 重復(fù)性

取龜甲膠、黃明膠、阿膠對照藥材混合溶液6份，按所建方法進(jìn)行檢測，分別計(jì)算3種對照藥材MRM色譜峰面積，龜甲膠峰面積RSD為3.8%，黃明膠峰面積RSD為4.5%，阿膠峰面積RSD為2.7%，結(jié)果表明所建方法重復(fù)性良好。

2.7 樣品測定

收集市場常見品牌的龜甲膠飲片18批，按本實(shí)驗(yàn)所建方法對樣品進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果表明，全部批次樣品檢出龜甲膠特征肽離子對，即符合《中華人民共和國藥典》（2015年版）鑒別項(xiàng)下相應(yīng)規(guī)定。其中3批樣品檢出牛皮源成分，全部樣品未檢出驢皮源成分（或低于檢測限）。

3 討論

UPLC-MS/MS具有分離能力強(qiáng)，分析時間短及高選擇性、高靈敏度等優(yōu)勢，近年來被廣泛應(yīng)用于藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[7-9]?！吨腥A人民共和國藥典》（2015年版）首次將液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于膠類藥材的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，規(guī)定以質(zhì)荷比（m/z）631.3（雙電荷）→546.4和（m/z）631.3（雙電荷）→921.4作為龜甲膠的特征肽段離子對，從而應(yīng)用于龜甲膠的鑒別[1]。此外，國家食品藥品監(jiān)督管理總局于2014年7月17日發(fā)布了“龜甲膠中牛皮源與驢皮源成分檢測”的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法（編號：2014013），規(guī)定龜甲膠中不得檢出牛皮源特征肽離子對[（m/z）641.3→726.2和（m/z）641.3→783.3]及驢皮源特征肽離子對[（m/z）539.8→612.4和（m/z）539.8 → 923.8][10]。

本實(shí)驗(yàn)基于UPLC-MS/MS方法，建立了同時檢測龜甲膠飲片中龜甲膠、牛皮源和驢皮源成分的測定方法，所建方法可專屬性檢測龜甲膠、黃明膠、阿膠的特征肽離子對，且互無干擾，3種對照藥材的方法檢測限均在0.5～2.0 mg/L范圍內(nèi)，方法靈敏度高，滿足龜甲膠飲片中牛皮源、驢皮源成分的“摻假”檢查。此外，所建方法將藥典的龜甲膠鑒別方法與補(bǔ)充檢驗(yàn)方法中驢皮源、牛皮源成分檢查方法相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了龜甲膠、牛皮源、驢皮源等成分的同時測定，進(jìn)一步縮短了分析時間，提高檢測效率，且方法重復(fù)性好，可用于實(shí)際樣品測定，為龜甲膠飲片的質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2015年版)一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:181-182.

[2]程顯隆,李文杰,魏鋒,等.動物膠類藥材的鑒別方法研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2011, 7(3):167-169.

[3]彭婷婷,江勛.超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測不同品種龜甲制龜甲膠的牛皮源成分[J].中國藥業(yè), 2016,25(10): 72-73.

[4]程顯隆,李文杰,張小龍,等. UPLC-QTOF-MS結(jié)合主成分分析法用于龜甲膠、鹿角膠中添加牛皮源成分的檢測研究[J].藥物分析雜志, 2012, 32(6): 931-935.

[5]李明華,龍國友,程顯隆,等.超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法用于中成藥中膠類成分的檢測研究[J].中國藥學(xué)雜志, 2015, 50(24): 2151-2153.

[6]劉琳,張貴鋒,查圣華,等.中藥龜甲膠的質(zhì)量控制方法研究[C].中國中藥雜志編委會暨中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制與產(chǎn)業(yè)化發(fā)展戰(zhàn)略研討高端論壇,2011.

[7]李曉東,林琳,丁麗霞.液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在藥品質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J].中國藥師, 2010, 13(5): 645-647.

[8]郝剛.液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在2015年版《中國藥典》中藥標(biāo)準(zhǔn)中的應(yīng)用[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn), 2017, 18(3):171-174.

[9]范學(xué)海,朱頤申,陳蘭婷,等.液質(zhì)聯(lián)用在多肽及蛋白質(zhì)定性方面的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報,2014,27(6):62-66.

[10]國家食品藥品監(jiān)督管理總局,藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件2014013[S].北京,2014.