小麥和榛子過敏原成分檢測的實時熒光PCR方法

尚柯，張彪，段慶梓，張玉，王巍，梁恒興

(成都食品藥品檢驗研究院，四川 成都，610045)

過敏原(allergen)，又稱為變應原、過敏物、致敏原、致敏物。GB/T 23779—2009規(guī)定，能夠誘發(fā)機體發(fā)生過敏反應的抗原物質(zhì)，被稱過敏原。食品過敏源是指普通食品中正常存在的天然或人工添加物質(zhì)，被過敏體質(zhì)人群消耗后能夠誘發(fā)過敏反應。食物過敏原一般為相對分子質(zhì)量10～70kDa的蛋白質(zhì)或糖蛋白，可分為主要過敏原與次要過敏原，大多數(shù)過敏患者對主要過敏原敏感[1]。目前大約有160多種食品含有可以導致過敏反應的食品過敏原[2]，常見的食品有：奶類(牛奶、羊奶等)，堅果(杏仁、巴旦木、山核桃、榛子等)，菜籽(葵花籽、芝麻等)，豆類(花生、大豆、豌豆、蠶豆等)，蛋類，巧克力，水果，海產(chǎn)品(蝦、蟹類)等。

據(jù)統(tǒng)計，2%的成人和5%～8%的兒童存在不同程度的食品過敏。僅僅在美國，每年就有3 000人因食物過敏緊急住院，150～200人死亡[3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)表明, 目前全球有 22%～25%的人患有過敏性疾病, 并以每10年23倍的速度增加，在我國就有兩億多人患有過敏性疾病，由食品過敏引發(fā)的過敏疾病已占過敏總數(shù)的 90%左右。

過敏原已成為重要的食品安全問題，因此評價和檢測食品過敏原生物活性日益受到重視。同時，由于發(fā)達國家已對進出口食品過敏原標識進行了嚴格要求，食物過敏原甚至成為進出口貿(mào)易的壁壘。因此，如何快速準確地檢測出食物中的過敏原成為當前亟需解決的問題。

目前常用的過敏原檢測方法有免疫學檢測、DNA檢測、質(zhì)譜及SPR等技術(shù)。張世偉等[4]通過運用雙抗夾心ELISA法檢測食品中的雞蛋過敏原，得出 IC50為 260 ng/mL，檢出限為10 ng/mL，樣品的添加回收率為84.2%～89.8%，可以快速檢測雞蛋過敏原。BATISTA等[5]利用對大豆過敏病人血清，通過雙向電泳技術(shù)結(jié)合 Western blotting檢測方法，從非轉(zhuǎn)基因大豆中檢測出了43種致敏蛋白。PUERTA等[6]采用免疫層析技術(shù)在痕量水平上定位β-乳球蛋白，得出實際檢測限為20.7 pmol/L，靈敏度為1.05×109AUmol-1L。

LU等[7]通過SPR技術(shù)對沙丁魚肌肉中的過敏原蛋白小清蛋白進行檢測，結(jié)果顯示靈敏度高達 0.11 mg/kg。CHASSAIGNE等[8]就采用四極桿―飛行時間質(zhì)譜儀檢測出了花生中的主要過敏原蛋白Ara h1、Ara h2、Ara h3/4。VANDEKERCKHOVE等[9]利用LC-MS技術(shù)檢測辣椒中的痕量花生過敏原成分，檢出限可達24 mg/kg。

聚合酶鏈式反應(PCR)技術(shù)起始于20世紀90年代中期，目前在過敏原檢測中已有應用。關(guān)瀟等[10]通過PCR方法檢測10種不同食品的牛奶過敏原，利用牛奶過敏原蛋白α-乳白蛋白基因序列設計引物的檢測靈敏度可達0.04 ng DNA，這一結(jié)果表明該法對牛奶過敏原的檢測具有較高的準確性和可靠性。CRUZ等[11]通過實時熒光 PCR 方法檢測巴西堅果中的過敏原成分，利用其中的2S白蛋白基因作為引物，得到檢測限為2.5 mg/kg。周新虹[12]采用Trizol法反轉(zhuǎn)錄RNA，克隆Ara h7 cDNA序列，并分析了表達蛋白的特征。SANTACLARA等[13]利用實時熒光PCR方法，檢測食品中的蝦、蟹等甲殼動物的過敏原成分，可在40 min內(nèi)完成檢測工作。ESPIEIRA等[14]通過建立一種食品中檢測大豆過敏原成分的PCR方法，為保護消費者提供了一種思路。GARCA等[15]利用Taqman探針法檢測食品中的堅果過敏原成分，檢出限達到0.1 mg/kg。WU等[16]采用多重實時熒光PCR技術(shù)，分析柑橘的過敏原，并促進育種“allergy-friendly”水果。LINACERO等[17]采用實時熒光PCR技術(shù)檢測核桃的主要過敏原Jugr1、Jugr3、Jugr4，檢出限可達0.01%。

PCR法在復雜食品中過敏原的定量分析及物種鑒定方面，具有快速、高效、準確、適用性廣、成本低廉、操作簡便等優(yōu)點，這使PCR方法在食物過敏原檢測方面，存在極大的優(yōu)勢，適合國際法規(guī)所要求的食品中過敏原成分的檢測原則。

目前，過敏原成分的PCR方法檢測已有較多方法及標準，但這些方法和標準均存在一定的問題，如SN/T 1961.13—2013檢測小麥時，發(fā)現(xiàn)有些品系的小麥無法檢測，檢測部分產(chǎn)地的小麥粉無法獲得陽性結(jié)果；SN/T 1961.8—2013針對榛子的結(jié)構(gòu)基因進行設計，并非過敏原基因，這可能導致某些脫敏食品仍然被檢測為含過敏原成分。同時，標準的檢出限可達0.01%，考慮到食品行業(yè)生產(chǎn)的特殊性，同一條生產(chǎn)線常常用來生產(chǎn)多類產(chǎn)品，很多無意添加將會被檢出，這將導致假陽性現(xiàn)象頻發(fā)，給實驗檢測帶來較高的風險。本課題通過在國際免疫學會官方查詢易過敏食品的主要過敏原成分，確定小麥、榛子的主要過敏原基因，建立一套完整的、標準化的、準確率高的、系統(tǒng)的過敏原檢測技術(shù)，以解決現(xiàn)有方法及標準所存在的問題。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

熒光定量擴增試劑盒(Bio-rad、Transgen公司)，引物及熒光探針(Invitrogen公司)，自動化儀器96深孔板磁力架AUTO-96-1(Borhee公司)，NUNC 96孔U型深孔板(Borhee公司)，磁珠法植物DNA提取試劑盒(Magen公司)。

1.2 儀器與設備

Bio-rad Cfx 96 Touch實時熒光PCR儀，Eppendorf Mini Spin 離心機，Eppendorf Centrifuge 5427 R高速冷凍離心機，IKA渦懸振蕩器，Implen P330核酸蛋白定量儀，Retsch MM400行星球磨儀，Thermo-Shaker BG-100干式恒溫器，Milli-Q Academic實驗室超純水儀，蘇州凈化SW-CJ-FD型單人單面凈化工作臺。

1.3 樣品信息

本實驗建立了小麥、榛子過敏原檢測的的實時熒光PCR方法，建立方法所用樣品見表1，檢出限驗證所用樣品見表2，適用性驗證樣品見表3。

表1 方法建立所用樣品Table 1 Samples used in method establishment

表2 檢出限驗證所用樣品Table 2 Samples used in LOD

注：均為質(zhì)量分數(shù)。

表3 適用性驗證所用樣品Table 3 Samples used in applicability verification

續(xù)表3

注：無小麥麩質(zhì)樣品包括蕎麥類、玉米、燕麥等預包裝食品；無榛子油質(zhì)蛋白樣品包括花生、瓜子、腰果等預包裝食品。

1.4 PCR引物

具體引物探針序列見表4。熒光基團為FAM熒光，猝滅基團為BHQ。

表4 過敏原實驗所用引物探針序列Table 4 Primer & probe sequence used in allergen experiment

1.5 方法

1.5.1 樣品基因組的提取

對小麥、榛子樣品及60批預包裝產(chǎn)品進行樣品前處理，用球磨儀研磨成粉，取約30 mg樣品，按照Magen的磁珠法植物DNA提取試劑盒說明書提取及基因組，放于-20 ℃保存。

1.5.2 實時熒光PCR試驗

首先用核酸蛋白定量儀確定DNA提取的效率與純度，進行OD260/OD280值測定，測得值均在1.7～1.9之間，表明可用于PCR實驗；然后將提取成功的基因組樣品進行PCR擴增，其反應體系見表5。

表5 實時熒光PCR反應體系Table 5 Reaction system of Real-time fluorescent PCR

配制完畢后充分混勻進行PCR反應，其反應條件見表6。

表6 實時熒光PCR反應條件Table 6 Reaction conditions of real-time fluorescence PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 方法設計與質(zhì)控體系建立

根據(jù)國際免疫學會官方提交的物種主要過敏原信息，確定所選取的過敏原基因，參照GenBank中已提交的2個物種的主要過敏原序列，確定小麥(triticum aestivum)的過敏原特異性基因CM16、榛子(corylus avellana)的過敏原特異性基因Cora1，并與常見偽品序列進行比對分析，保證引物探針的特異性。運用DNA序列分析網(wǎng)站http://sg.idtdna.com/calc/analyzer對檢測各物種的熒光定量PCR引物和TaqMan探針進行序列高級結(jié)構(gòu)分析比對，以確保其高度的特異性，防止出現(xiàn)二聚體、莖環(huán)及發(fā)卡等影響檢測效率的結(jié)構(gòu)。

依據(jù)此引物探針進行PCR反應，對每個品種各5種正品、8～10種偽品進行實時熒光PCR鑒定，保證能夠特異性區(qū)分正品與偽品。根據(jù)實時熒光PCR反應原理及相關(guān)食品檢測標準，考慮到食品行業(yè)檢測樣本的復雜性，根據(jù)檢出限設定本方法的判定原則為：

(1)陰性對照、空白對照不得有CT值；

(2)當樣品CT值≤35，有典型擴增曲線時，判定為檢出；

(3)當樣品CT值>35，無典型擴增曲線時，判定為未檢出；

(4)當樣品無CT值，判定為未檢出。

2.2 內(nèi)參實驗驗證

DNA提取成功后檢測DNA濃度及純度，顯示濃度均在10 ng/μL以上，A260/280均在1.7～1.9之間，證明DNA提取效果良好，可用于實時熒光PCR實驗。

為了進一步確認DNA的提取效率，我們建立了內(nèi)參驗證實驗，進行18Sr RNA驗證，以保證DNA可用于實時熒光PCR檢測，驗證結(jié)果見圖1。

圖1 內(nèi)參實時熒光PCR結(jié)果
Fig.1 Reference real-time PCR results of internal-reference

內(nèi)參實驗驗證成功，CT值均在15～30之間，證明DNA提取效果理想，可用于過敏原特異性檢測。

2.3 實時熒光PCR方法特異性驗證

引物與探針的特異性需要驗證其種內(nèi)適用性與種間特異性，以確定該引物與是否能滿足檢測的需要。

進行小麥正品與偽品的實時熒光PCR反應，實時熒光反應體系見表5、表6，實時熒光反應結(jié)果見結(jié)果見圖2。

圖2 小麥CM16過敏原實時熒光PCR結(jié)果
Fig.2 Real-time PCR results of wheat CM16 allergen

結(jié)果顯示，XM1-XM5五個含目標基因的正品有擴增曲線，XM6-XM13不含目標基因的偽品無擴增曲線，表明引物探針特異性滿足檢測要求。

進行榛子正品與偽品的實時熒光PCR反應，實時熒光反應體系見表5、6，實時熒光反應結(jié)果見結(jié)果見圖3。

圖3 榛子Cor a 1過敏原實時熒光PCR結(jié)果
Fig.3 Real-time PCR results of hazelnut Cor a 1 allergen

結(jié)果顯示，ZZ1-ZZ5五個含目標基因的正品有擴增曲線，ZZ6-ZZ14九個不含目標基因的偽品無擴增曲線，表明引物探針特異性滿足檢測要求。

2.4 方法重復性驗證

通過換用Transgen的實時熒光PCR預混液，在相同的實驗條件下，對方法進行重復性驗證，結(jié)果見圖4、圖5。

圖4 小麥CM16過敏原重復性驗證
Fig.4 Repeatability verification of wheat CM16 allergen

圖5 榛子Cor a 1過敏原重復性驗證
Fig.5 Repeatability verification of of hazelnut Cor a 1 allergen

重復性驗證結(jié)果表明，在使用不同試劑盒時，同樣的實驗條件下均可獲得一致的檢測結(jié)果，證明本方法的重復性可滿足檢測要求。

2.5 方法檢出限驗證

為了確定方法的檢出限，我們將小麥、榛子烘干后，用球磨儀研成粉末狀，并與其他樣品粉末混勻，進行DNA提取，具體混樣信息見表2，以確定本實驗建立的方法檢測靈敏度。具體檢測結(jié)果見圖6、圖7、表7。

圖6 小麥過敏原檢出限實時熒光PCR結(jié)果
Fig.6 RT-PCR results of wheat allergens LOD

圖7 榛子過敏原檢出限實時熒光PCR結(jié)果
Fig.7 RT-PCR results of hazelnut allergens LOD

表7 檢出限實時熒光PCR結(jié)果及判定Table 7 RT-PCR results and determine of LOD

結(jié)果顯示，10%濃度、1%濃度的小麥和榛子樣品檢測CT值在35以下，判定為含有小麥(或榛子)過敏原成分；而0.1%濃度的小麥和榛子樣品檢測CT值在35以上，判定為不含小麥(或榛子)過敏原成分。表明本實驗建立的方法可以準確檢測過敏原成分含量在1%以上的樣品，即方法的檢出限為1%。

2.6 方法適用性驗證

為了驗證方法的可靠性與適用性，我們選擇了60批預包裝樣品(具體信息見表3)，進行方法的驗證實驗，結(jié)果見表8和表9。

對樣品進行DNA提取，經(jīng)檢測DNA濃度均在10～100 ng/μL之間，A260/280均在1.7～1.9之間。我們建立了內(nèi)參驗證實驗，進行18Sr RNA驗證，以保證60批樣品的DNA均可用于實時熒光PCR檢測，驗證結(jié)果見圖8。

圖8 樣品18S rRNA內(nèi)參實驗
Fig.8 18S rRNA reference experiment

根據(jù)實驗熒光PCR結(jié)果可以看出，60批預包裝樣品的DNA結(jié)果理想，內(nèi)參實驗全部成功，CT值均在13～20之間，空白對照無CT值，表明所提取的DNA可用于實時熒光PCR檢測。

對30批XQ編號樣品進行小麥過敏原CM16實時熒光檢測法的適用性驗證，驗證結(jié)果見圖9、表8。

圖9 小麥CM 16實時熒光結(jié)果
Fig.9 RT-PCR results of wheat CM16

表8 小麥CM 16實時熒光結(jié)果Table 8 RT-PCR results of wheat CM16

結(jié)果顯示，實時熒光判定結(jié)果與樣品實際情況一致，含有小麥麩質(zhì)樣品均檢出CT值，判定為含有過敏原成分；不含小麥麩質(zhì)的樣品CT值均>35或無CT值，判定為不含小麥過敏原成分，適用性驗證結(jié)果符合預期，表明本實驗建立的方法可用于小麥過敏原成分檢測的常規(guī)應用。

對30批ZZ編號樣品進行榛子過敏原Cora1實時熒光檢測法的適用性驗證，驗證結(jié)果見圖10、表9。

圖10 榛子Cor a 1實時熒光PCR結(jié)果
Fig.10 RT-PCR results of hazelnut Cor a 1

表9 榛子Cor a 1基因?qū)崟r熒光結(jié)果Table 9 RT-PCR results of hazelnut Cor a 1

結(jié)果顯示，實時熒光判定結(jié)果與樣品實際情況一致，含有榛子油質(zhì)蛋白過敏原成分的樣品均檢出CT值，判定為含有榛子過敏原成分；不含榛子油質(zhì)蛋白過敏原成分的樣品CT值均>35或無CT值，判定為不含榛子過敏原成分，適用性驗證結(jié)果符合預期，未出現(xiàn)假陽性或假陰性現(xiàn)象，表明本實驗建立的方法可用于榛子過敏原成分檢測的常規(guī)檢測。

3 結(jié)論

通過對本研究所建立的方法進行討論分析，我們發(fā)現(xiàn)，實驗室建立的實時熒光PCR檢測方法可以準確、高效地檢測樣品中的小麥、榛子過敏原成分，其特異性好，操作簡便，適用性廣，對市售常見預包裝食品均可準確檢測過敏原成分，可以作為過敏原檢測的常規(guī)檢測方法。

由于免疫學檢測方法的準確性和特異性主要依賴于抗體識別食物過敏原，但某些食品工業(yè)常利用熱加工、超高壓和酶解等深加工技術(shù)使過敏原蛋白發(fā)生變性和降解，而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變又可干擾蛋白提取物或抗體結(jié)合部位，同時會導致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)[18]；此外，由于某些過敏原缺少特異性的單克隆抗體，無法利用ELISA法進行檢測。而新興的質(zhì)譜、SPR等技術(shù)所需的設備相對昂貴，并且對樣品要求較高，不適合作為普通實驗室及快檢實驗室的常規(guī)檢測手段，因此在過敏原檢測方面限制了其應用。

實時熒光PCR法作為一種新型檢測技術(shù)，在過敏原檢測中發(fā)揮了越來越重要的作用。它有效地解決了免疫學方法存在的無法檢測加工食品、假陰性率高等問題，并且儀器較為廉價，對人員經(jīng)驗及操作要求較低，且檢測成本極低，準確率高，重復性好，適用性強，遍于普及應用。因此，實時熒光PCR法將是過敏原檢測的重要發(fā)展方向，我們初步建立了小麥、榛子的過敏原檢測方法，并適當調(diào)整了方法的檢出限，以降低檢測誤判所帶來的風險。同時，我們建立了過敏原基因的數(shù)據(jù)庫，為將來的實時熒光PCR檢測方法開發(fā)提供了理論基礎與數(shù)據(jù)支持。