QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定蜂蜜中21種磺胺類藥物殘留

容裕棠，張憲臣，張朋杰，李蓉，黃偉蓉，陳麗斯

(廣東出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術(shù)中心中山分中心，廣東 中山，528403)

磺胺類藥物(sulfonamides,SAs)是指具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，用于養(yǎng)蜂行業(yè)中可以防治蜂病、降低蜜蜂死亡率、提高蜜蜂生產(chǎn)性能，但是由于其在蜜蜂體內(nèi)代謝降解緩慢，如果不遵守休藥期規(guī)定、超量使用，易造成蜂產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留[1-2]。如果人體長期攝入含其的蜂蜜產(chǎn)品，當(dāng)積累到一定程度后，會對身體造成損傷[3-5]。大多數(shù)國家對磺胺類藥物進(jìn)行了最大殘留量的規(guī)定。國際食品法典委員會(CAS)和歐盟等規(guī)定食品中的磺胺總量及單個磺胺的含量不能超過100 μg/kg。日本規(guī)定了更為嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，如磺胺喹惡啉為50 μg/kg、磺胺甲基嘧啶為20 μg/kg、磺胺二甲嘧啶為10 μg/kg等。我國農(nóng)業(yè)部235號文件《動物性食品中獸藥殘留的最高殘留量》中規(guī)定牛、羊奶及蜂蜜中磺胺類最大殘留量(MRL)為100 μg/kg。國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局對動物源性食品中磺胺類藥物殘留的重點監(jiān)控項目主要包括：磺胺嘧啶、磺胺鄰二甲嘧啶、磺胺喹惡啉、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺甲惡唑、磺胺氯噠嗪、甲氧芐啶等。

目前，國內(nèi)外對磺胺類藥物殘留檢測主要有：酶聯(lián)免疫法[6]、氣相色譜法[7-8]、高效液相色譜法[9-10]、液相-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-19]等。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法采用保留時間與特征離子對比例對已知目標(biāo)物進(jìn)行定性和定量分析,準(zhǔn)確性和靈敏度優(yōu)勢明顯，近年來已成為流行的檢測方法并被廣泛應(yīng)用，當(dāng)前多藥物殘留的高通量檢測也集中在此法。QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，RuggedandSafe)是基于分散固相萃取發(fā)展起來的一種集萃取和凈化為一體的新型前處理方法[20-21]，能夠有效地縮短前處理時間，提高檢測效率，已在農(nóng)藥殘留檢測、臨床醫(yī)學(xué)、獸藥及醫(yī)藥殘留等領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用[22-24]。本研究利用QuEChERS前處理方法對蜂蜜中磺胺類藥物殘留進(jìn)行凈化處理，超高效液相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用法(UPLC-MS/MS)進(jìn)行測定，建立蜂蜜中21種磺胺類藥物的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

乙酸乙酯(色譜純)；甲醇(色譜純)；甲酸(色譜純)；二氯甲烷(分析純)；H3PO4(分析純)；檸檬酸(分析純)；Na2HPO4(分析純)；NaCl(分析純)；無水Na2SO4(分析純)；超純水(Millipore Milli-Q)；Mcllvaine緩沖溶液：1 000 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液與625 mL 0.1 mol/L Na2HPO4溶液混合。

吸附劑：C18、PSA、NH2(分析純,上海安譜)。

21種磺胺標(biāo)準(zhǔn)品：甲氧芐啶CAS:738-70-5(trimethoprim，TMP)、磺胺二甲異嘧啶CAS:515-64-0(sulfisomidine，SIM)、磺胺嘧啶CAS:68-35-9(sulfadiazine，SDZ)、磺胺噻唑CAS:72-14-0(sulfathiazole，STZ)、磺胺吡啶CAS:144-83-2(sulfapyridine，SPD)、磺胺甲基嘧啶CAS:127-79-7(sulfamerazine，SMR)、磺胺甲氧嗪CAS:80-35-3(sulfamethoxypyridazine，SMP)、磺胺甲二唑CAS:144-82-1(sulfamethizole，SMT)、磺胺二甲嘧啶CAS:57-68-1(sulfadimidine，SDM)、磺胺對甲氧嘧啶CAS:651-06-9(sulfamethoxydiazine，SMD)、磺胺氯達(dá)嗪CAS:80-32-0(sulfachlorpyridazine,SCP)、磺胺甲惡唑CAS:723-46-6(sulfamethoxazole,SMZ)、磺胺間甲氧嘧啶CAS:1220-83-3(sulfamonomethoxine,SMM)、磺胺鄰二甲氧嘧啶CAS:2447-57-6(sulfadoxine,SDX)、磺胺異惡唑CAS:127-69-5(sulfafurazole,SFZ)、磺胺惡唑CAS:729-99-7(sulfamoxole,SMO)、磺胺苯酰CAS:127-71-9(sulfabenzamide,SBA)、磺胺苯吡唑CAS:526-08-9(sulfaphenazole，SPA)、磺胺間二甲氧嘧啶CAS:122-11-2(sulfadimethoxine,SDT)、磺胺喹惡啉CAS:59-40-5(sulfaquinoxaline,SQX)，磺胺硝苯CAS:122-16-7 (sulfanitran,SAN)，純度均大于等于99%(德國，Dr.Ehrensorfer)。

6種內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺二甲嘧啶-D4(CAS:1020719-82-7)，磺胺喹噁啉-13C6(CAS:1202864-52-5)，磺胺間甲氧嘧啶-D4，磺胺鄰二甲氧嘧啶-D3，甲氧芐啶-D3(CAS:1189923-38-3)，磺胺嘧啶-D4(CAS:1020719-78-1)純度均大于等于98%(德國，Dr.Ehrensorfer)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取21種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品約10.0 mg，于各自的100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于-18 ℃冰箱中避光保存，有效期3個月。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確吸取甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)儲備液50 μL和其余20種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)儲備液100 μL至100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度配成各磺胺類藥物相應(yīng)質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL(甲氧芐啶為0.05 μg/mL)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，有效期3個月。

1.3 儀器與設(shè)備

Ekspert ultraLC 100型超高效液相色譜儀、AB Sciex Triple Quad 5500質(zhì)譜儀[配有電噴霧(ESI)源]美國，AB Sciex；高速離心機，美國，Thermo；VORTEX-3渦旋振蕩器，德國，IKA；TurboVap氮吹濃縮儀，瑞典，Biotage。

1.4 分析條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Waters Atlantis T3,3 μm,2.1 mm×150 mm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動相：A為0.02%甲酸水溶液，B為甲醇，梯度洗脫程序：0～7 min,75% A；7～9 min，35% A；9～9.1 min，75% A；9.1～15 min，75% A。流速：0.3 mL/min。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；噴霧電壓：5 500 V；鞘氣壓力：35 L/mim；輔助氣流量：6 L/min;離子傳輸管溫度：475 ℃；掃描模式：多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。

其他條件見表1。

表1 測定21種磺胺類藥物的串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of 21 sulfonamides

續(xù)表1

注：*為定量碎片離子。

1.5 樣品處理

準(zhǔn)確稱取蜂蜜試樣1 g(精確至0.01 g)至50 mL具塞離心管中，加入混合內(nèi)標(biāo)工作溶液20 μL(1 μg/mL)后再加入5 mL Mcllvaine緩沖溶液(pH=4)，渦旋混合2 min使試樣完全溶解。加入20 mL 1 %甲酸乙腈提取，渦旋混合2 min后依次加入1 g NaCl和3 g Na2SO4，渦旋振蕩2 min，以15 ℃ 5 000 r/min離心10 min。取10 mL上清液于15 mL具塞離心管中，加入200 mg NH2吸附劑，渦旋振蕩2 min，以上述相同條件離心10 min后取5 mL上清液至10 mL玻璃管中，于50 ℃氮吹濃縮儀吹干。準(zhǔn)確加入1 mL[乙腈+0.02%甲酸水溶液(體積比1∶9)]溶解殘渣，過0.22 μm有機相濾膜后，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法優(yōu)化

2.1.1 不同稀釋液對磺胺類藥物的影響

針對蜂蜜基質(zhì)，如預(yù)先不加入水相進(jìn)行預(yù)溶，則難溶于后續(xù)萃取過程中的有機溶劑(如乙腈、乙酸乙酯等)，因此通常加入水或適當(dāng)?shù)木彌_鹽溶液進(jìn)行稀釋，使其形成均相體系，便于磺胺類藥物的提取。本文選擇陰性蜂蜜樣品為實驗材料，添加濃度為10 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個樣品3平行對稀釋液進(jìn)行優(yōu)化。實驗對比了水、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% H3PO4和Mcllvaine緩沖溶液3種稀釋溶液。由于蜂蜜基質(zhì)中含有大量水分，磺胺類藥物在穩(wěn)定的弱酸性緩沖鹽體系下能更好得溶解出來，結(jié)果表明，采用Mcllvaine緩沖溶液稀釋后的蜂蜜樣品對各類磺胺藥物殘留的回收率最為理想，見圖1。

圖1 不同稀釋液的21種磺胺類回收率
Fig.1 The recovery rate of 21 sulfonamide in different diluents

2.1.2 不同萃取溶劑對磺胺類藥物的影響

樣品經(jīng)緩沖溶液稀釋溶解后，選擇陰性蜂蜜樣品為實驗材料，添加濃度為10 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個樣品3平行對萃取溶劑進(jìn)行優(yōu)化。由于磺胺類藥物易溶于極性有機溶劑，分別考察了乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷3種萃取溶劑：乙酸乙酯和二氯甲烷對蜂蜜等復(fù)雜樣品有較大的基質(zhì)增強效應(yīng)，在色譜圖上表現(xiàn)為噪音過大，對各類磺胺分離效果不佳(見圖2)，且選取乙腈作為萃取溶劑時回收率較其他兩者高，大部分目標(biāo)物回收率為80%～110%。

圖2 乙酸乙酯的萃取效果色譜圖
Fig.2 Extraction chromatogram of ethyl acetate

另外從磺胺類藥物的分子結(jié)構(gòu)上考慮，由于基團上有呈弱酸性磺酰胺基，在乙腈中加入適當(dāng)?shù)乃嵝匀芤河兄诟玫靥崛『碗婋x，且酸化乙腈能更好得使蜂蜜中蛋白質(zhì)沉淀，因此本文選取1%甲酸乙腈作為萃取溶劑，3種萃取溶劑對各類磺胺的平均回收率見圖3。

圖3 不同萃取溶劑對21種磺胺回收率
Fig.3 The recovery rate of 21 sulfonamide in different solvernts

2.1.3 不同分散固相吸附劑對磺胺類藥物的影響

傳統(tǒng)的磺胺類藥物的凈化方法一般采用正己烷或者固相萃取小柱，但由于蜂蜜基質(zhì)成分復(fù)雜，基質(zhì)干擾大，正己烷凈化只能去酯，而采用固相萃取小柱凈化效果較好但其成本高、操作復(fù)雜、耗時，不適用于大批量樣品同時檢測，本文采用分散固相吸附劑進(jìn)行凈化，選擇陰性蜂蜜樣品為實驗材料，添加濃度為10 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個樣品3平行對分散固相吸附劑進(jìn)行優(yōu)化，分別考察了C18、PSA、GCB和NH2這幾種目前較為常用的吸附劑：GCB主要用于去除葉綠素、類胡蘿卜素等色素化合物，但蜂蜜中不含有葉綠素、類胡蘿卜素等物質(zhì)，因此不加入GCB。C18主要吸附非極性化合物(如脂肪)，但對蜂蜜中糖類共提物吸附效果有限；PSA可以吸附多種色素、糖、和脂肪酸，但相比于NH2對磺胺類藥物吸附后的回收率低；采用NH2作為分散固相吸附劑時，各類磺胺類藥物殘留在基質(zhì)中響應(yīng)最理想，不同吸附劑對各類磺胺平均回收率的效果見圖4。

圖4 不同吸附劑對21種磺胺的回收率
Fig.4 The recovery rate of 21 sulfonamide in different adsorbents

2.1.4 吸附劑的用量對磺胺類藥物的影響

選擇陰性蜂蜜樣品為實驗材料，添加濃度為10 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個樣品3平行對吸附劑用量進(jìn)行優(yōu)化，分別比較了3種吸附劑用量(100、200、300 mg)對各類磺胺回收率影響。試驗表明，使用100 mg時，由于用量小，去除糖、有機酸、脂肪酸等雜質(zhì)的效果有限，回收率稍低；增加用量至300 mg時，可能由于吸附劑過多導(dǎo)致額外吸附目標(biāo)化合物，回收率不增反減，因此選取200 mg作為吸附劑用量，不同吸附劑用量對各類磺胺回收率的影響見圖5。

圖5 不同吸附劑用量對各類磺胺的回收率
Fig.5 The recovery rate of 21 sulfonamide in different dosage of adsorbent

2.1.5 鹽析劑和吸水劑對磺胺類藥物的影響

在提取過程中，向蜂蜜樣品溶液中加入無機鹽既可以改變待測組分的提取效率，又有利于水相和有機相間的分層。實驗選用目前較為常用的鹽析劑NaCl，吸水劑無水Na2SO4。試驗中選擇陰性蜂蜜樣品為實驗材料，添加濃度為10 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個樣品3平行對鹽析劑和吸水劑的用量進(jìn)行優(yōu)化。試驗表明，加入1 g NaCl、3 g無水Na2SQ4時，各磺胺類藥物回收率最理想(見圖6)，這是由于適量的NaCl和無水Na2SQ4能有效吸收多余水分、增加離子強度，從而使目標(biāo)化合物更容易從水相進(jìn)入有機相。

圖6 不同鹽析劑和吸水劑用量對21磺胺類藥物回收率
Fig.6 The recovery rate of 21 sulfonamide in different dosage of salting-out agent and SAP

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

磺胺類藥物都是以對位氨基苯磺酰胺為基本結(jié)構(gòu)的衍生物，屬于極性較強的化合物，本文選擇對極性較強的化合物分離較好的3款色譜柱：Atlantis T3 C18(3 μm,2.1 mm×150 mm)、RESTEK ultra AQ C18(100 mm×2.1 mm, 3.0 μm)、Thermo Hypersil GOLD C18(3 μm,2.1 mm×100 mm)對21種磺胺類藥物進(jìn)行分離。Thermo Hypersil GOLD(1.9 μm,2.1 mm×60 mm)對21種磺胺類藥物分離效果不佳；Thermo Hypersil GOLD C18(3 μm,2.1 mm×100 mm)這款色譜柱穩(wěn)定性差，無法保留磺胺甲氧達(dá)嗪(SMP)、磺胺對甲氧嘧啶(SMD)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)這3種磺胺類藥物、無法從基線上分離這3者(見圖7)。Atlantis T3 C18(3 μm,2.1 mm×150 mm)色譜柱對21種磺胺類藥物均有較好的保留，穩(wěn)定性高，滿足試驗要求，因此選取此款色譜柱進(jìn)行分析。

圖7 Thermo Hypersil GOLD C18(3 μm,2.1 mm×100 mm)
對磺胺甲氧達(dá)嗪(SMP)、磺胺對甲氧嘧啶(SMD)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)分離效果
Fig.7 Separating effect of SMP，SMD，SMM by thermo hypersil GOLD C18(3 μm,2.1 mm×100 mm)

2.2.2 流動相的選擇

為同時使21種磺胺類藥物殘留均達(dá)到滿意的分離度，選取了甲醇-0.02%甲酸水溶液、乙腈-0.02%甲酸水溶液、甲醇-水和乙腈-水4種不同的流動相進(jìn)行對比，試驗結(jié)果表明：以甲醇-0.02%甲酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫時，低濃度的甲酸水溶液能使21種磺胺類藥物較好得分離，各類磺胺類藥物的響應(yīng)顯著增加，化合物峰形尖銳，原因可能在于低濃度的甲酸水溶液能提供適當(dāng)?shù)馁|(zhì)子，從而在離子源打碎目標(biāo)物時能提高離子化程度，而甲醇相較于乙腈的洗脫能力弱，能更好得將21種磺胺類藥物進(jìn)行有效分離，混合標(biāo)準(zhǔn)品離子流圖見圖8。

圖8 21種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品離子色譜圖(各類磺胺質(zhì)量濃度為2 ng/mL)
Fig.8 Standard ion chromatogram of 21 sulfonamide

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

堿性磺胺類化合物選取電噴霧離子源正離子模式進(jìn)行分析，將21種磺胺類藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至1 μg/mL進(jìn)樣，選擇定量母離子掃描方式(Q1)確定各分子離子，然后對其子離子進(jìn)行二級全掃描(Q2),確認(rèn)21種磺胺類藥物的離子對，優(yōu)化碰撞能量、鞘氣、輔助氣等參數(shù),同時使21種磺胺類藥物分子離子與特征離子碎片的離子對強度比例較大且穩(wěn)定時，得到適用于磺胺類的最佳質(zhì)譜條件,各化合物質(zhì)譜檢測參數(shù)見表2。

2.4 線性范圍與檢出限

稱取空白蜂蜜樣品，分別精確加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液，在選定的色譜和質(zhì)譜條件下測定，以信噪比(S/N)3為最低檢出限(LOD)，信噪比(S/N)10為定量檢出限(LOQ)，各化合物的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限(LOD、LOQ)見表2。試驗結(jié)果表明，21種磺胺在0.05～60 ng/mL內(nèi)具有良好線性，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。

2.5 方法的回收率、精密度

稱取空白蜂蜜樣品1 g(精確至0.01 g)，選取低、中、高3個合適濃度分別添加標(biāo)準(zhǔn)溶液(具體見表3)，每個加標(biāo)水平平行6次，從空白樣品與添加樣品的譜圖看，內(nèi)標(biāo)和被測物的絕對基質(zhì)效應(yīng)接近(見圖9)，試驗結(jié)果表明，3個濃度的加標(biāo)回收率在60.44%～107.80%間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.21%～8.93%，滿足試驗要求。

圖9 空白樣品(a)、加標(biāo)樣品(b)和內(nèi)標(biāo)樣品(c)的基質(zhì)效應(yīng)比較
Fig.9 Comparison of matrix effects of blank sample(a)、standard-added sample(b) and internal standard-added sample(c)

表3 方法的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries and RSD of the method

續(xù)表3

3 小結(jié)

本文建立了蜂蜜中21種磺胺類藥物殘留的QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的測定方法，方法靈敏，準(zhǔn)確，省時，穩(wěn)定，實用性強，試驗表明：該法檢出限在0.12～2.46 μg/kg，定量限在0.40～8.19 μg/kg，回收率在60.44%～107.80%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.21%～8.93%，方法學(xué)結(jié)果滿足GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》的技術(shù)要求，適用于食品實驗室大量蜂蜜樣品的快速檢測。