響應(yīng)面法優(yōu)化鱘魚(yú)精蛋白肽的酶解提取

白嬋，饒丹華,2，熊光權(quán)，磨定信，張金木，王寶華，李寧，廖濤*

1(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所/湖北省農(nóng)產(chǎn)品輻照工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢，430064) 2(武漢工程大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢，430073)3(武漢鱘龍生物科技有限公司，湖北 武漢，430015)

合成藥物和添加劑總是伴隨有一定的毒性，通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ǚ蛛x天然活性物質(zhì)不僅可以保持功能活性物質(zhì)，還可大大降低對(duì)機(jī)體的致毒性和免疫性，并且分子質(zhì)量越小安全性越高吸收也越好，因此，小分子質(zhì)量的天然活性蛋白肽類(lèi)近年來(lái)越來(lái)越成為研究重點(diǎn)。CHEN[1]等人發(fā)現(xiàn)大豆多肽具有良好的抗氧化性，可以顯著抑制脂質(zhì)的過(guò)氧化進(jìn)程。MOURE等[2]的研究表明不同分子質(zhì)量的大豆多肽組分當(dāng)中，分子質(zhì)量小于10 kDa的組分抗氧化活性最強(qiáng)。

魚(yú)精蛋白是魚(yú)類(lèi)精巢組織當(dāng)中一類(lèi)具有多種藥用功能的蛋白質(zhì)，并且在體外心臟循環(huán)手術(shù)當(dāng)中充當(dāng)重要的抗肝素劑[3]，此外還具有良好的抑菌譜特性，早在1937年M UYTTENDAELE就報(bào)道了魚(yú)精蛋白具有抗菌活性[4]。魚(yú)精蛋白作為異種蛋白在臨床上仍有過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生[5]，王萬(wàn)娟等[6]就曾報(bào)道魚(yú)精蛋白致使過(guò)敏者出現(xiàn)毛細(xì)血管滲漏綜合征。劉妍妘[7]通過(guò)ELISA和Western-blotting分析確定了大黃魚(yú)魚(yú)精中的主要過(guò)敏原為12 kDa的蛋白組分。通過(guò)酶解，降低活性蛋白分子量可以有效避免過(guò)敏。

目前為止除了王勇剛等[8-9]鮮少有酶解魚(yú)精蛋白多肽的研究，現(xiàn)在我國(guó)已成為世界鱘魚(yú)第一養(yǎng)殖大國(guó)，年產(chǎn)量約15 000 t，鱘魚(yú)向來(lái)以高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值著稱(chēng)，蛋白質(zhì)含量高，8種必需氨基酸評(píng)分均超過(guò)WHO推薦的成人氨基酸需要量模式[10]。鱘魚(yú)-甲骨板是達(dá)氏鰉和史氏鱘的雜交品系，由于其生長(zhǎng)快，抗病力強(qiáng)，已在湖北省乃至全國(guó)廣泛人工養(yǎng)殖。且甲骨板精巢組織(俗稱(chēng)魚(yú)白)較大，約占魚(yú)體重的8%，本實(shí)驗(yàn)對(duì)淡水鱘魚(yú)-甲骨板精蛋白肽的酶解工藝進(jìn)行探究，通過(guò)構(gòu)建優(yōu)化方案制備魚(yú)精蛋白肽，為相應(yīng)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)，提供鱘魚(yú)加工副產(chǎn)物的綜合價(jià)值，從而推動(dòng)鱘魚(yú)產(chǎn)業(yè)鏈的快速發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源與主要試劑

1.1.1 原料及來(lái)源

鱘魚(yú)(AcipensersturioLinnaeus)魚(yú)白(固態(tài)組織)由武漢鱘龍生物科技有限公司于2016年春季提供。

1.1.2 主要試劑

胃蛋白酶(3 000 U/mg)，木瓜蛋白酶(650 U/mg)，胰蛋白酶(650 U/mg),Sigma-Aldrich公司；NaCl，濃H2SO4，乙醇，乙醚，異丙醇等(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-25MS高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，武漢科爾儀器設(shè)備有限公司；凱氏定氮裝置，蜀?；x器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鱘魚(yú)魚(yú)精蛋白肽的提取[11-12]

鱘魚(yú)魚(yú)白解凍后置于高速組織搗碎機(jī)中搗碎，稱(chēng)取10 g加入100 mL 0.14 moL/L NaCl溶液，勻漿1 min后，冰浴中攪拌20 min，靜置10 min，4 000 r/min低溫(0 ℃)離心分離10 min，棄去上清液。重復(fù)上述操作1次，棄去上清液。沉淀用體積比為2∶2∶8的乙醚-異丙醇-蒸餾水脫脂浸提液在恒溫?fù)u床中脫脂3 h，重復(fù)脫脂1次，離心棄上清液。

沉淀按一定比例加水勻漿，加入一定量活性的酶，調(diào)至最佳pH，在一定溫度恒溫水浴酶解一定時(shí)間。結(jié)束用沸水浴滅酶10 min，冷卻后5 000 r/min低溫(0 ℃)離心15 min，取上清液冷凍干燥。以水解度為指標(biāo)指示工藝選擇。

1.3.2 檢測(cè)方法

蛋白氮含量測(cè)定：凱氏定氮法[13]。

游離氨基氮含量測(cè)定：甲醛滴定法[14]。

(1)

式中：DH,水解度；A0，原料蛋白氮含量；A1酶解游離氨基氮含量；A2，酶解液游離氨基氮含量。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

選用木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶對(duì)樣品進(jìn)行酶解，隨后繼續(xù)對(duì)最佳蛋白酶酶解實(shí)驗(yàn)的加酶量、液料比、酶解時(shí)間、pH值、酶解溫度值等條件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

(a)選酶。原料按液料比20∶1加入蒸餾水，對(duì)應(yīng)調(diào)至木瓜蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶最適pH值，分別加入24 000 U/g加酶量的木瓜蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶。30 ℃恒溫提取2 h。每組3個(gè)平行。

(b)加酶量。原料按液料比20∶1加入蒸餾水，調(diào)pH值至6.3，分別加入1.5%, 2%, 3%, 4%, 6%, 8%的木瓜蛋白酶。30 ℃恒溫提取2 h。每組3個(gè)平行。

(c)液料比。原料分別按液料比10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1加入蒸餾水，調(diào)pH值至6.3，加入3%的木瓜蛋白酶。30 ℃恒溫酶解2 h。每組3個(gè)平行。

(d)酶解時(shí)間。原料按液料比20∶1加入蒸餾水，調(diào)pH值至6.3，加入3%的木瓜蛋白酶。30 ℃恒溫提取，提取時(shí)間分別為2，4，6，8，10 h。每組3個(gè)平行。

(e)pH值。原料按液料比20加入蒸餾水，調(diào)pH分別為4、5、6、7、8，加入3%的木瓜蛋白酶。35 ℃恒溫酶解2 h。每組3個(gè)平行。

(f)酶解溫度。原料按液料比20∶1加入蒸餾水，調(diào)pH值至6.3，加入3%的木瓜蛋白酶。在30、40、50、55、60、70 ℃下分別恒溫酶解2 h。每組3個(gè)平行。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面法依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)[15]，進(jìn)一步優(yōu)化最佳工藝條件。檢測(cè)指標(biāo)為魚(yú)精蛋白肽水解度，試驗(yàn)編碼和水平如下表所示。

表1 響應(yīng)面分析因子及水平Table 1 Analysis factors and levels in Box-Behnken design

1.3.5 蛋白肽的抑菌實(shí)驗(yàn)

采用濾紙片法[16-17]測(cè)試提取蛋白多肽的抑菌性，用無(wú)菌水作空白對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.0軟件處理作圖，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert V8.0.6軟件處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

由圖1-A可看出，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶均能夠使鱘魚(yú)魚(yú)白中的蛋白肽鍵斷裂，產(chǎn)生一定的水解度，其中木瓜蛋白酶的水解程度最佳，可以獲得更多小分子質(zhì)量魚(yú)精蛋白肽，遠(yuǎn)優(yōu)于胃蛋白酶?？赡苁囚~(yú)精蛋白中主要成分為精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸，而木瓜蛋白酶相對(duì)另外2種酶與這3種氨基酸具有較好的結(jié)合能力。采用木瓜蛋白酶試驗(yàn)加酶量、液料比、酶解時(shí)間、pH值、酶解溫度等工藝條件對(duì)水解度的影響如圖1-B～圖1-F所示。

木瓜蛋白酶添加量對(duì)蛋白的水解度影響顯著，在未達(dá)到3%添加量時(shí)，底物充足，少量添加酶都可以迅速提高水解進(jìn)程，但達(dá)到3%后底物的酶解達(dá)到飽和，酶的繼續(xù)增多只會(huì)引起水解度在一定范圍內(nèi)上下波動(dòng)，此外基于經(jīng)濟(jì)考慮，酶添加量3%最合適。圖1-C說(shuō)明酶解的液料比具有峰形規(guī)律，鱘魚(yú)魚(yú)白溶液過(guò)濃過(guò)稀都不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行。過(guò)濃使得溶液黏性大，阻礙了酶與底物的傳質(zhì)過(guò)程；過(guò)稀又使得酶與底物結(jié)合的效率降低，因此在液料比30∶1時(shí)，水解度達(dá)到峰值，條件最佳。圖1-D表明，酶解時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)可使酶解更充分，但達(dá)到8 h后，由于蛋白水解達(dá)到飽和平衡，繼續(xù)酶解作用不大，因此最佳酶解時(shí)間為8 h。酶解過(guò)程溶液的pH值和溫度同樣對(duì)酶解過(guò)程有影響，且均是在較低區(qū)域產(chǎn)生較大影響，pH值和溫度由低增大，水解程度呈現(xiàn)先快速提高后輕微下降的趨勢(shì)。pH值和溫度主要對(duì)木瓜蛋白酶的活性產(chǎn)生影響，在pH值為7.0，溫度55 ℃的溶液環(huán)境中，木瓜蛋白酶的活性最大，制備小分子蛋白肽的效果也最佳。

圖1 單因素對(duì)魚(yú)精蛋白水解度的影響
Fig.1 Effect of single factors on protamine hydrolysis degree

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)原理，以水解度DH為響應(yīng)值，以加酶量A，酶解時(shí)間B，液料比C組成的3因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)水解度的結(jié)果如表2所示。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results

續(xù)表2

2.2.2 響應(yīng)面模型可靠性分析

Design-expert軟件通過(guò)擬合的回歸模型，得出蛋白水解度關(guān)于加酶量A、酶解時(shí)間B和液料比C的多元二次回歸方程為：

DH=-30.129 75+7.642 00A+5.885 50B-0.040 450C+0.165 00AB-0.025 500AC+0.012 250BC-1.307 00A2-0.416 75B2+4.325E-4C2

軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)擬合得到魚(yú)精蛋白肽提取工藝的模型分析參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

為了檢驗(yàn)構(gòu)建模型的有效性，如表3所示對(duì)模型進(jìn)行方差分析[18-19]。模型F值為24.32表明模型是顯著的，由噪聲引起的系統(tǒng)誤差僅有0.02%的發(fā)生概率。當(dāng)p值大于0.1時(shí)表示該模型項(xiàng)對(duì)水解程度的影響不顯著，而本預(yù)測(cè)模型p值遠(yuǎn)小于0.05說(shuō)明模型條件具有顯著性，該模型中A，B，AC，BC，A2，B2均是顯著影響項(xiàng)。失擬項(xiàng)的F值為0.4表示與誤差相關(guān)的失擬項(xiàng)不顯著，且模型R2=0.969 0，預(yù)測(cè)模型與實(shí)際情況的吻合度達(dá)到96.9%，綜上，該預(yù)測(cè)模型可以良好準(zhǔn)確地反映實(shí)際工藝情況，分析得出的最佳酶解工藝科學(xué)性、準(zhǔn)確性和可靠性高。

2.2.3 響應(yīng)面因素分析

預(yù)測(cè)模型對(duì)各個(gè)因素項(xiàng)和因素交互項(xiàng)進(jìn)行的顯著性分析結(jié)果如下：

表4 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 4 Coefficients of the regression model and theirsignificance test

由表4可知，回歸模型中，因素A(加酶量)的p值=0.000 8遠(yuǎn)小于0.01，表明加酶量對(duì)鱘魚(yú)魚(yú)精蛋白的水解影響極其顯著。因素B(酶解時(shí)間)的p值為0.01<0.038 8<0.05，表明酶解時(shí)間對(duì)鱘魚(yú)魚(yú)精蛋白水解度影響較為顯著，因素C(液料比)的p值為0.061 8，大于0.05，表明液料比對(duì)鱘魚(yú)魚(yú)精蛋白的水解影響不顯著，可以得知底物物料和酶量一定且酶解足夠長(zhǎng)時(shí)間如8 h時(shí)，底物溶液的濃度不會(huì)顯著影響蛋白水解的平衡，只是會(huì)影響酶解過(guò)程達(dá)到平衡的時(shí)間快慢。單因素實(shí)驗(yàn)中酶解時(shí)間僅為2 h，酶解過(guò)程不充分，所以濃度適當(dāng)增大既減少溶液的粘滯阻力又有足夠大的碰撞概率，會(huì)對(duì)酶解過(guò)程的水解度產(chǎn)生較大影響，與8 h的不明顯影響相區(qū)別。3個(gè)因素對(duì)水解度的影響依次為：加酶量>酶解時(shí)間>液料比。交互項(xiàng)的影響依次為：AC>BC>AB[20]，AC、BC對(duì)水解度影響均較為顯著。二次項(xiàng)中的B2、A2對(duì)水解度的影響極其顯著，p值均小于等于0.000 1，說(shuō)明加酶量和酶解時(shí)間是酶解工藝中必須要重點(diǎn)控制的條件。二次項(xiàng)3個(gè)因素顯著性：B2>A2>C2。以上說(shuō)明加酶量、酶解時(shí)間、液料比三個(gè)因素之間相互影響，并不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.3 二次交互項(xiàng)分析

加酶量、酶解時(shí)間和液料比兩兩交互作用對(duì)魚(yú)精蛋白水解度的影響情況如圖2～圖4所示。

由圖可知加酶量與液料比、液料比與酶解時(shí)間之間的交互作用較強(qiáng)，等高線(xiàn)圖均呈明顯的橢圓形，結(jié)果與上表的p值結(jié)果一致。而加酶量與酶解時(shí)間的等高線(xiàn)圖顯示類(lèi)似圓形，加酶量與酶解時(shí)間交互作用較小，二者線(xiàn)性作用關(guān)系較強(qiáng)，對(duì)魚(yú)精蛋白水解度產(chǎn)生疊加影響。

圖2 液料比為30時(shí)，酶解時(shí)間和加酶量對(duì)魚(yú)精蛋白水解度的影響
Fig.2 Effect of enzyme extraction time and pepsin amount on the extraction rate of protamine, when solvent-to-solid ratio is 30

圖3 酶解時(shí)間為8 h時(shí)，液料比和加酶量對(duì)魚(yú)精蛋白水解度的影響
Fig.3 Effect of solvent-to-solid ratio and pepsin amount on the extraction rate of protamine, when enzyme time is 8 hours

圖4 加酶量為3.0%，液料比和酶解時(shí)間對(duì)魚(yú)精蛋白水解度的影響
Fig.4 Effect of solvent-to-solid ratio and enzyme extraction time on the extraction rate of protamine, when pepsin amount is 3.0%

2.2.4 最佳工藝及驗(yàn)證

響應(yīng)面軟件經(jīng)過(guò)擬合分析得到鱘魚(yú)精蛋白肽的最佳提取工藝為：液料比為39.72∶1，木瓜蛋白酶添加量3%，酶解時(shí)間8.22 h，此時(shí)預(yù)測(cè)的魚(yú)精蛋白水解度最大為5.36%。

經(jīng)重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)證明，在預(yù)測(cè)模型最佳提取工藝條件下，實(shí)際的魚(yú)精蛋白水解度平均達(dá)到5.44%，與模型預(yù)測(cè)值極為接近，證明最佳工藝預(yù)測(cè)值準(zhǔn)確。

2.2.5 抑菌性分析

最優(yōu)工藝條件下，1%濃度的魚(yú)精蛋白肽溶液浸泡濾紙?zhí)幚淼拇竽c桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基有明顯的抑菌圈，蒸餾水浸泡的濾紙片周?chē)渖L(zhǎng)不受影響沒(méi)有抑菌圈，魚(yú)精蛋白肽抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌效果顯著，如圖5、圖6所示。

圖5 魚(yú)精蛋白肽與對(duì)照組對(duì)大腸桿菌的抑制作用
Fig.5 Inhibitory effect of protamine peptide and the contrast against Escherichia coli

圖6 魚(yú)精蛋白肽與對(duì)照組對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用
Fig.6 Inhibitory effect of protamine peptide and the contrast against Staphylococcus aureus

3 結(jié)論

本文首次對(duì)鱘魚(yú)精蛋白功能活性肽進(jìn)行提取，對(duì)比發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)魚(yú)精蛋白酶解的影響存在明顯差異，其中木瓜蛋白酶的酶解效率最高，在單因素條件實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理構(gòu)建鱘魚(yú)精蛋白肽酶解工藝的響應(yīng)面模型，并通過(guò)回歸分析優(yōu)化得到最終的提取工藝為：液料比為39.72，木瓜蛋白酶添加量3%，酶解提取環(huán)境為pH 7.0，溫度55 ℃，酶解反應(yīng)時(shí)間8.22 h。并且驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明最佳工藝條件下魚(yú)精蛋白水解度最大達(dá)到5.44%。所制備的鱘魚(yú)精蛋白肽對(duì)常見(jiàn)致病菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌圈，抑菌活性良好，對(duì)鱘魚(yú)精蛋白多肽的理化功能特性尚有待進(jìn)一步研究，為多肽產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。