袁學文,王炎冰
1(廣東第二師范學院 生物與食品工程學院,廣東 廣州,510303) 2(肇慶興億海洋生物工程有限公司,廣東 肇慶,526238)
免疫活性肽是一類具有增強機體免疫力、提高機體抵抗外源病原體感染能力、增強巨噬細胞吞噬能力等免疫功能的肽[1]。機體功能正常的情況下,會對外源性抗原產(chǎn)生排異反應(yīng),發(fā)揮免疫保護作用[2]。食源性免疫活性肽不具備免疫原性,能以肽的形式被人體腸道吸收與受體結(jié)合,從而發(fā)揮增強機體免疫作用[3]。目前國內(nèi)外對乳清蛋白和酪蛋白水解得到的免疫活性肽研究較多[4-5]。據(jù)報道,乳源性活性肽可以顯著提高淋巴細胞增殖率,激發(fā)巨噬細胞吞噬活性,提高機體抵抗外源性抗原感染的能力[6-7]。另外,小麥肽[8]、大豆肽[9]等植物源生物活性肽也可以顯著提高抗體生成細胞活性及促進脾淋巴細胞增殖,從而增強機體的免疫功能。
海洋生物活性肽,從海洋原料中提取獲得,由于海洋生物特殊的生長環(huán)境(高壓、高鹽、缺氧等),賦予其優(yōu)異的生物活性[10]。遠東擬沙丁魚(Sardinopssagax),又名斑點莎腦魚,主要分布于日本近海和我國的黃海海域,具有生長快、繁殖力強、價格低廉等優(yōu)點。遠東擬沙丁魚年捕撈量達500萬t左右,通常加工為飼料,生產(chǎn)價值低,其資源并未得到充分利用[11]。據(jù)報道,遠東擬沙丁魚蛋白肽具有降低血壓、促進細胞修復(fù)、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin coverting enzyme, ACE)、抗氧化等多種生物活性,是制備生物活性肽的優(yōu)質(zhì)原料。MATSUFUJI等[12]利用堿性蛋白酶酶解沙丁魚,得到具有降血壓作用的活性肽。王晶晶等[13]以遠東擬沙丁魚為原料,通過膜分離等工序得到蛋白多肽,可以很好地抑制ACE。GARCA等[14]從沙丁魚、馬鮫魚、小斑點貓鯊等5種魚類中提取蛋白肽,經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)沙丁魚蛋白肽的抗氧化活性最高,其亞鐵螯合物含量為0.32 mg/mL。遠東擬沙丁魚可能具有增強免疫力的功能,具有很大的研究價值。
本文以遠東擬沙丁魚為原料,通過蛋白酶酶解和膜分離等技術(shù)制備遠東擬沙丁魚低聚肽,并研究其化學組成和免疫活性功能,以細胞實驗來驗證對小鼠免疫能力的增強作用,為遠東擬沙丁魚資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。
遠東擬沙丁魚(Sardinopssagax),體長14~20 cm,2016年11月購于廣東省茂名市博賀港,冷凍運輸?shù)綄嶒炇?,?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
人參烏雞口服液,北京同仁堂健康藥業(yè)股份有限公司;動物蛋白水解酶(14.5 萬U/g)、風味酶(14 萬U/g),南寧龐博生物工程有限公司;RPMI1640培養(yǎng)基,GIBCO公司;胎牛血清(FBS),GIBCO公司;青/鏈霉素雙抗,杭州吉諾生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品;Hank’s,杭州吉諾生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品;ConA,廣州威佳科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
Thermo M原子吸收光譜儀,德國Thermo公司;UV-2450 型紫外分光光度計,日本島津公司;OMLG-25噴霧干燥器,上海歐蒙實業(yè)有限公司; FOSS 2300全自動凱氏定氮儀,瑞士FOSS公司;臺式高速大容量冷凍離心機,艾德本中國有限公司;SW-CJ-2FD型超凈工作臺,蘇州凈化有限公司;HHT4-LX-C50L型立式壓力蒸汽滅菌器,北京中西遠大科技有限公司;MCO-175 CO2培養(yǎng)箱,日本三洋公司;PHS-3C pH計,上??茖W儀器有限公司;管式離心機GQ75B,上海章泉有限公司;多功能酶標儀,美國Thermo公司;FA2104A分析天平,上海天平儀器廠;SHZ-B水浴恒溫振蕩器,江蘇佳美儀器公司;高效液相色譜儀(LC-20AT),美國Waters公司;QL-901混合器,上海精科實業(yè)有限公司;Multiskan Go全波長酶標儀,Thermo Fisher Scientific公司;CKX41型倒置顯微鏡,日本 Dickinson公司。
BALB/c 雄性小鼠、Hartley 雄性豚鼠,SPF級;小鼠初始體重為18.0~22.0 g,Hartley 豚鼠初始體重為355.6~472.2 g,購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。小鼠質(zhì)量合格證編號:44007200008675;豚鼠質(zhì)量合格證明編號:44007200009223。動物飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學動物實驗中心SPF級動物房,實驗動物使用許可證號:SYXK(粵)2013-0002。動物飼養(yǎng)條件:4~5只/箱,群養(yǎng);飼養(yǎng)溫度與濕度:20~26 ℃,40%~70%,采用10 h:14 h晝夜間斷照明,自由進食、飲水。
1.4.1 遠東擬沙丁魚低聚肽的制備
遠東擬沙丁魚→去頭去骨→酶解→滅酶(90~100 ℃)→離心→脫油→脫色、脫苦(珍珠巖)→0.2 μm陶瓷膜過濾→截留分子質(zhì)量為5 000 u的超濾膜進行超濾→真空濃縮→噴霧干燥→低聚肽。
將遠東擬沙丁魚去頭、皮、骨及內(nèi)臟,清洗后絞碎,勻漿,在一定條件下酶解3 h(溫度50 ℃,添加動物蛋白水解酶0.5%、風味酶0.1%,自然條件),之后在90~100 ℃條件下加熱10 min,使蛋白質(zhì)變性。之后再在4 000 r/min離心,取上清液于管式離心機中脫油,再加入珍珠巖(添加比例為3 g/100g)脫色,得到的澄清液先用陶瓷膜(孔徑0.2 μm)過濾,再用截留分子質(zhì)量為5 000 u的超濾膜超濾,取濾液濃縮再噴霧干燥,得到遠東擬沙丁魚低聚肽粉,于4 ℃干燥條件下保存?zhèn)溆肹15]。
1.4.2 遠東擬沙丁魚低聚肽分子質(zhì)量分布測定
委托江南大學分析測試中心測定,參考國標GB/T 22492—2008的方法。
1.4.3 遠東擬沙丁魚低聚肽各項指標測定
游離氨基酸測定:GB/T 5009.124—2003;牛磺酸含量測定:GB/T 5009.169—2003;色氨酸含量測定:GB/T 15400—1994;鈣含量測定:GB/T 5009.92—2003;鉀含量測定:GB/T 5009.91—2003;鈉含量測定:GB/T 5009.91—2003;硒含量測定:GB 5009.93—2010;鋅含量測定:GB/T 5009.14—2003;能量測定:GB/Z 21922—2008;蛋白質(zhì)含量測定:GB 5009.5—2010;脂肪含量測定:GB/T 5009.6—2003;碳水化合物含量測定:GB/Z 21922—2008;低聚肽含量:GB/T 22729—2008/6.3;灰分含量測定:GB 5009.4—2010;鉛含量測定:GB 5009.12—2010;無機砷測定:GB/T 5009.11—2003;鎘含量測定:GB/T 5009.15—2003;甲基汞含量測定:GB/T 5009.17—2003。
1.4.4 遠東擬沙丁魚低聚肽增強免疫力功能評價
委托廣東省醫(yī)學實驗動物中心測定,參考中華人民共和國衛(wèi)生部頒發(fā)《保健食品檢測與評價技術(shù)規(guī)范》 2003版中保健食品功能成分評價方法。
1.4.4.1 遠東擬沙丁魚低聚肽對正常小鼠ConA誘導(dǎo)脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響
參考侯虎[16]的方法,稍作改動。
取BALB/c雄性小鼠70只,按體重隨機分為陰性對照組、烏雞人參口服液組、供試品高、中、低劑量組,每14只分為一組,共5組。各組小鼠每天按0.2 mL/10g體重灌胃給予相應(yīng)樣品液,陰性對照組給予等量純凈水,1次/d,連續(xù)30 d。每天觀察記錄動物的日常情況1次;每周稱量小鼠體重1次。于末次給藥1 h,無菌取脾,置于盛有適量無菌Hank’s液平皿中,將脾磨碎,制成單細胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾,用Hank’s液洗2次,每次離心10 min(1 000 r/min)。然后將細胞懸浮于1 mL完全培養(yǎng)液中,用臺芬蘭染色計數(shù)活細胞數(shù),調(diào)整細胞濃度3.0×106個/mL。每份脾細胞懸液分成2組,一組加10 μL ConA液(5μg/mL),另外一組為對照,于5% CO2,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)27 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h加50 μL(5 μg/mL)MTT,結(jié)束后于1 000g離心10 min。取沉淀加入180 μL DMSO,溶解液后于波長580 nm下測定吸光度值。
1.4.4.2 遠東擬沙丁魚低聚肽對正常小鼠體液免疫功能的影響
參考侯虎[16]的方法,稍作改動。
補體的制備:采集豚鼠血,分離出血清(5只豚鼠的混合血清),將1 mL壓積SRBC加入到5 mL豚鼠血清中,4 ℃冰箱放置30 min,振蕩后離心取上清液,分裝,-80 ℃保存(d48)。使用時用SA緩沖液按1∶8稀釋。
取BALB/c雄性小鼠70只,按體重隨機分為陰性對照組、烏雞人參口服液組、供試品高、中、低劑量組,每14只分為一組,共5組。各組小鼠每天按0.2 mL/10g體重灌胃給予相應(yīng)樣品液,陰性對照組給予等量純凈水,1次/d,連續(xù)30 d。SRBC免疫小鼠:給藥25 d后,取脫纖維的羊血,生理鹽水洗滌3次,每次離心(2 000 r/min)10 min,壓積SRBC用生理鹽水配成體積分數(shù)為2%的細胞懸液,每只小鼠注射0.2 mL。SRBC免疫小鼠4 d后(d30),末次給藥1 h,頸椎脫臼處死,去脾臟進行抗體生成細胞檢測。將脾臟碾碎,用Hank’s 液配成細胞懸液,過200目篩網(wǎng),并將細胞濃度調(diào)整為3.0×106個/mL。培養(yǎng)基(1 g瓊脂糖加雙蒸水定容到100 mL)加熱溶解于50 ℃保溫,與等量pH 7.2~7.4 Hank’s液混合,取混合液0.5 mL,加入50 μL體積分數(shù)為10%的SRBC(用SA緩沖液配置),20 μL批細胞懸液,混勻后傾倒與瓊脂糖薄層片上,待瓊脂凝固后,放入CO2培養(yǎng)箱中孵育1~1.5 h,加入SA緩沖液稀釋的補體(1∶8),溫育1~1.5 h后,計算溶血空斑數(shù)。
1.4.4.3 遠東擬沙丁魚低聚肽對正常小鼠單核-巨噬細胞功能的影響
參考侯虎[16]的方法,稍作改動。
取BALB/c雄性小鼠70只,按體重隨機分為陰性對照組、烏雞人參口服液組、供試品高、中、低劑量組,每14只分為一組,共5組。各組小鼠每天按0.2 mL/10 g體重灌胃給予相應(yīng)樣品液,陰性對照組給予等量純凈水,1次/d,連續(xù)30 d。末次給藥滿1 h,按10 mL/kg體重從尾部靜脈注射稀釋的印度墨汁[V(25%印度墨汁)∶V(生理鹽水)=1∶3]。注入墨汁后2 min和10 min,分別從眼眶靜脈叢采血20 μL,加入2 mL 0.1% Na2CO3溶液中,以Na2CO3溶液作空白對照,于600 nm波長處測定OD值,計算吞噬指數(shù)a,并測定脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。
(1)
(2)
式中:t1表示墨水注射后2 min的時間;t2表示墨水注射后10 min的時間;OD1表示墨水注射后2 min樣品的OD值;OD2表示墨水注射后10 min樣品的OD值。
1.4.4.4 遠東擬沙丁魚低聚肽對正常小鼠NK細胞活性的影響
參考侯虎[16]的方法,稍作改動。
取BALB/c雄性小鼠70只,按體重隨機分為陰性對照組、烏雞人參口服液組、供試品高、中、低劑量組,每14只分為一組,共5組。各組小鼠每天按0.2 mL/10g體重灌胃給予相應(yīng)樣品液,陰性對照組給予等量純凈水,1次/d,連續(xù)30 d。
脾細胞懸液制備:末次給藥1 h,解剖小鼠取出胸腺、脾臟,計算臟器系數(shù)。將脾臟碾碎,用Hank’s 液配成單細胞懸液,過200目篩網(wǎng),棄上清液將細胞漿加入0.5 mL滅菌水20 s,紅細胞裂解后加入8 mL Hank’s 液,于1 000 r/min離心10 min,用1 mL RPMI 1640完全培養(yǎng)液重懸,用體積分數(shù)為1%冰醋酸稀釋后染色計活細胞數(shù),調(diào)整細胞濃度為2×107個/mL。
自然殺傷細胞(natural killer cell, NK細胞)活性檢測:取靶細胞和效應(yīng)細胞各100 μL(效靶比50∶1),加入U型96孔培養(yǎng)板中;靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養(yǎng)液各100 μL,靶細胞最大釋放孔加靶細胞和25 g/L Triton各100 μL;設(shè)置3個平行,與37 ℃,體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,然后將96孔培養(yǎng)板于1 500 r/min離心5 min,每孔吸取上清100 μL置平底96孔培養(yǎng)板中,同時加入LDH基質(zhì)液100 μL,室溫反應(yīng)5 min,每孔加入1 mol/L的HCl溶液30 μL,在酶標儀490 nm處測定光密度值(OD)。
(3)
式中:OD0表示靶細胞自然釋放孔的OD值;OD1表示靶細胞最大釋放孔的OD值;OD2表示反應(yīng)后樣品的OD值。
實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準偏差(n=13)表示,使用 JMP 10.0和 Excel 2013 軟件進行數(shù)據(jù)處理和顯著性分析。
近些年,國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn),從海洋生物中提取的肽類具有良好的生物活性,其活性成分主要集中在3 000 u以下[17-18]。不同來源的活性肽其分子質(zhì)量不同,而不同分子質(zhì)量的肽也表現(xiàn)不同的生物活性[10,19]。QIAN等[20]從乳酸桿菌發(fā)酵液中提取多肽,研究發(fā)現(xiàn)當肽的分子質(zhì)量為3 000~5 000 u 時,其抗氧化活性比較高。STUKNYTE等[21]報道,從牛乳乳酸菌發(fā)酵液中分離得到多肽,分子質(zhì)量小于3 000 u的組分能顯降低Caco32細胞中NF-kB因子的活性,具有免疫調(diào)節(jié)的作用。由表1可知,遠東擬沙丁魚低聚肽中分子質(zhì)量在1 000 u以下的組分,占比為96.57%。其中分子質(zhì)量1 000~500 u的組分比例為16.74%,分子質(zhì)量500~180 u的組分比例為52.39 %,分子質(zhì)量小于180 u的組分比例為27.44%。分子質(zhì)量500~180 u的組分占比為最大,其數(shù)均分子質(zhì)量和重均分子質(zhì)量分別為257 u和282 u。
表1 遠東擬沙丁魚低聚肽分子量分布Table 1 Distribution of SSO weight
注:“/”表示未檢出。
表2 遠東擬沙丁魚低聚肽粉中氨基酸的含量Table 2 The contents of amino acids in SSO
遠東擬沙丁魚低聚肽中營養(yǎng)成分與微量成分結(jié)果如表3。樣品中的主要成分為蛋白質(zhì),占總干重的91.1%,能量為1 548 kJ/100g,低聚肽含量為66.4 g/100g,灰分含量為4.8 g/100g。硒是人體所必須的微量元素,《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量》中規(guī)定成人推薦攝入量為50 μg/d,而國際營養(yǎng)科學會推薦富硒食品中硒含量為0.04~0.15 mg/100g[25]。低聚肽中硒的含量很高,為1.66 mg/100g,可以作為人體攝入硒元素的良好來源。其他常見的金屬元素和有害成分的含量,其比例小于1%。
表3 遠東擬沙丁魚低聚肽中營養(yǎng)成分與微量元素的含量Table 3 The contents of nutrients and trace elements in SSO
2.4.1 遠東擬沙丁魚低聚肽對正常小鼠ConA誘導(dǎo)脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響
ConA誘導(dǎo)脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果如表4所示,與陰性對照組相比,烏雞人參口服液組小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化OD值顯著性升高(p<0.05);樣品高劑量組小鼠的淋巴細胞轉(zhuǎn)化OD值顯著性增加(p<0.05);而樣品中、低劑量組小鼠的淋巴細胞轉(zhuǎn)化OD值與陰性對照組相比沒有顯著性差異(p>0.05),這呈現(xiàn)一種劑效關(guān)系。結(jié)果證明:烏雞人參口服液、沙丁魚低聚肽3個劑量對小鼠抗體生成細胞的測定為陽性,能增強小鼠脾淋巴細胞增殖能力。
表4 遠東擬沙丁魚低聚肽對正常小鼠脾淋巴細胞增殖率的影響Table 4 Effects of SSO on proliferation rate oflymphocytes in normal mice
注:*表示與陰性對照組相比有顯著性差異p<0.05。
脾臟是機體內(nèi)最大的外周免疫器官,也是淋巴細胞接受抗原刺激和產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要場所,在機體的免疫調(diào)節(jié)、免疫防御和免疫修復(fù)中都有著重要的作用。脾淋巴細胞在收到抗原物質(zhì)刺激后能分化增殖、發(fā)生特異性免疫應(yīng)答,是機體中最重要的免疫效應(yīng)細胞,因此淋巴細胞的增殖能力是反應(yīng)機體細胞免疫的重要指標[26]。據(jù)報道,有研究人員發(fā)現(xiàn)面筋蛋白酶解物[27]、玉米胚芽蛋白酶解物[28]中提取的肽類,與沙丁魚低聚肽的作用類似,可以顯著提高小鼠脾淋巴細胞增殖能力,這證明沙丁魚低聚肽具有增強淋巴細胞增殖的能力。
2.4.2 遠東擬沙丁魚低聚肽對正常小鼠體液免疫功能的影響
在補體的參與下,SRBC與致敏動物血清中的溶血素產(chǎn)生溶血反應(yīng)。血清中溶血素的含量可以通過溶血過程中的血紅蛋白來檢測,因此血清溶血素是代表機體體液免疫的重要指標[29]。遠東擬沙丁魚低聚肽對小鼠體液免疫功能的影響結(jié)果如表5所示,烏雞人參口服液,樣品低、中、高劑量組小鼠的脾臟指數(shù)均高于陰性對照組,但各組間的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均無顯著性差異(p>0.05)。與陰性對照組相比,烏雞人參口服液小鼠的空斑數(shù)極顯著性升高(p<0.05),樣品3個劑量組小鼠的空斑數(shù)均顯著性增加(p<0.05)。結(jié)果表明,烏雞人參口服液,沙丁魚低聚肽3個劑量對正常小鼠體液免疫功能結(jié)果為陽性。
表5 遠東擬沙丁魚低聚肽粉對正常小鼠體液免疫功能的影響Table 5 Effects of SSO on humoral immune function in normal mice
注:*表示與陰性對照組相比有顯著性差異,p<0.05。
2.4.3 遠東擬沙丁魚低聚肽對正常小鼠單核-巨噬細胞功能的影響
單核-巨噬細胞既是效應(yīng)細胞,又是免疫調(diào)節(jié)細胞。吞噬活性是巨噬細胞的一個重要特性。異體抗原侵入機體時,會引起巨噬細胞聚集并吞噬,反映了機體非特異性免疫功能[29]。遠東擬沙丁魚低聚肽對小鼠單核-巨噬細胞功能的影響結(jié)果如表6,各小組之間的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和肝臟系數(shù)均無統(tǒng)計學差異(p>0.05),而各組之間的吞噬指數(shù)也無顯著性差異(p>0.05)。結(jié)果表明,烏雞人參口服液、沙丁魚低聚肽對小鼠單核-巨噬細胞功能無顯著影響。沙丁魚低聚肽對單核-巨噬細胞功能增強不顯著,這可能與遠東擬沙丁魚蛋白的氨基酸組成有關(guān)。研究表明不同來源的食源性蛋白活性肽,因氨基酸組成、結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的不同,其生物活性功能也各不相同[3]。
表6 遠東擬沙丁魚低聚肽粉對正常小鼠單核-巨噬細胞功能的影響Table 6 Effects of SSO on mononuclear-macrophage function in normal mice
2.4.4 遠東擬沙丁魚低聚肽對正常小鼠NK細胞活性的影響
自然殺傷細胞(NK細胞)是一種具有異質(zhì)性功能的免疫細胞,是與特異性免疫應(yīng)答無關(guān)的自然殺傷細胞[29]。NK細胞對機體內(nèi)淋巴細胞有調(diào)節(jié)作用,其對異體抗原的殺傷作用不需要預(yù)先免疫或者致敏,是機體抗腫瘤的第一道防線。NK細胞在機體抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)活動中有著重要意義,其活性是檢驗免疫功能的重要指標[30]。傅煒昕等[31]研究發(fā)現(xiàn),凝膠過濾層析分離得到低分子地龍活性肽(分子質(zhì)量8 000~20 000)具有較強的增強免疫功能,可以提高NK細胞的殺傷率,并與IL-2具有協(xié)同作用。劉仁杰[32]報道,通過林蛙油提取小分子活性肽,通過小鼠NK細胞活性試驗發(fā)現(xiàn),中劑量組[300 mg/(kg·d]即可顯著增強NK細胞活性。遠東擬沙丁魚低聚肽對小鼠NK細胞活性的影響結(jié)果如表7所示,與陰性對照組相比,烏雞人參參照組小鼠的NK細胞活性顯著性升高(p<0.05),樣品高劑量組小鼠的NK細胞活性顯著性增加(p<0.05);而樣品中、低劑量組小鼠的NK細胞活性與陰性對照組相比無顯著性差異(p>0.05)。結(jié)果表明,烏雞人參口服液、沙丁魚低聚肽高劑量能顯著增強小鼠NK細胞活性。
注:*表示與陰性對照組相比有顯著性差異,p<0.05。
遠東擬沙丁魚低聚肽分子質(zhì)量主要在1 000 u以下,富含谷氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、硒等成分,具有增強正常小鼠免疫力的功能。遠東擬沙丁魚低聚肽可以作為增強免疫力保健食品的配料,具有廣闊的發(fā)展前景,而產(chǎn)品標準和生產(chǎn)技術(shù)在其產(chǎn)業(yè)化過程中尚待建立和不斷完善。