產(chǎn)抗菌肽PSI的重組乳酸克魯維酵母高密度發(fā)酵及產(chǎn)物的分離純化研究

翟立翔，李國麗，冷艷，李師翁,*，陳熙明，陳拓，劉光琇

1(蘭州交通大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070) 2(甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院沙漠與沙漠化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州，730000)

乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)是一種能高效表達(dá)外源蛋白的酵母表達(dá)系統(tǒng)，作為美國FDA認(rèn)證的食品安全級酵母[1]，具有遺傳穩(wěn)定，蛋白可翻譯后加工，產(chǎn)物可分泌到胞外，可高密度發(fā)酵且發(fā)酵過程無產(chǎn)氣現(xiàn)象，不會發(fā)生爆罐、發(fā)酵過程中所需的誘導(dǎo)劑是乳糖或半乳糖，相對甲醇誘導(dǎo)更安全、表達(dá)產(chǎn)物可直接應(yīng)用于食品及飼料工業(yè)中等優(yōu)點(diǎn)[2]，目前已經(jīng)有數(shù)百種外源蛋白在該系統(tǒng)中獲得表達(dá)。

抗菌肽PSI是植物天冬氨酸蛋白酶的前體，其典型特征是分子內(nèi)部有一個約由100個氨基酸殘基構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域，被稱為植物特異插入片段[2]，對植物病原真菌Verticilliumdahlia具有較強(qiáng)的抗性，其作用機(jī)制是通過與磷脂膜泡相互作用，在一定pH下或者依附于脂質(zhì)而誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)容物的裂解，從而殺死生物病原體，抑制真菌孢子的形成[3-4]。

高密度發(fā)酵是提高基因工程菌外源蛋白表達(dá)量的有效策略。迄今為止，已有數(shù)千種蛋白通過高密度發(fā)酵得以大量表達(dá)，如人的C型溶菌酶LYZL6表達(dá)量高達(dá)331 mg/L[5], 植酸酶酶活達(dá)1.34×104U/mL[6], 來自兔出血病病毒的衣殼蛋白表達(dá)量達(dá)16 mg/L[7], 麥角固醇表達(dá)量達(dá)1.5 g/L[8]等。但是，由于重組菌本身的局限性，如啟動子特性、密碼子使用頻率或基因拷貝數(shù)等，或者是由于發(fā)酵工藝的不同，外源蛋白表達(dá)量差異很大。目前，針對乳酸克魯維酵母高密度發(fā)酵，業(yè)界已經(jīng)建立了技術(shù)相對成熟的補(bǔ)料分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵兩種發(fā)酵方式[9]，在實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)上，主要研究補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝[10]的影響和調(diào)控。

發(fā)酵產(chǎn)物的分離、提取和純化是發(fā)酵工業(yè)中重要的步驟，分離純化技術(shù)的落后，會嚴(yán)重阻礙微生物工程產(chǎn)品的工業(yè)化進(jìn)程，使實(shí)驗(yàn)室成果無法轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力。本研究應(yīng)用重組乳酸克魯維酵母表達(dá)抗菌肽PSI，優(yōu)化了發(fā)酵罐發(fā)酵工藝，并對發(fā)酵液中抗菌肽PSI的分離純化方法進(jìn)行了比較和分析，采用SDS-PAGE檢測其純化效果，為發(fā)酵法制備抗菌肽PSI過程中的分離純化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

重組抗菌肽PSI乳酸克魯維酵母基因工程菌PN21由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[11]。

10～100 L雙聯(lián)發(fā)酵罐，江蘇鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司；小型垂直蛋白電泳儀，美國Bio-Rad 公司；Q-SepharoseTM-XL,Amersham公司；UFC超濾管,Millipore公司；臺式高速冷凍離心機(jī),利康發(fā)展有限公司；化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

微量鹽PTM(1L)：CuSO46g、NaI 0.08g、MnSO43 g、Na2MoO40.2g、H3BO30.02g、CoCl20.5g、ZnCl220g、FeSO465g、Biotin 0.25g、H2SO45mL，過濾除菌。

YDFM培養(yǎng)基(1 L)：(NH4)2SO410 g、葡萄糖30 g、精氨酸1 mmol、賴氨酸1 mmol、 KH2PO411.83 g、 K2HPO42.29 g、 MgSO41 g、CaCl20.33 g、NaCl 1 g、KCl 1 g、PTM 4.35mL。

YDFMY培養(yǎng)基(1 L)：(NH4)2SO410 g、葡萄糖30 g、精氨酸1 mmol、賴氨酸1 mmol、 KH2PO411.83 g、 K2HPO42.29 g、 MgSO41 g、CaCl20.33 g、NaCl 1 g、KCl 1 g、PTM 4.35 mL，酵母提取物10g，胰蛋白胨20 g。

BSM培養(yǎng)基(1 L)：85% H3PO40.387 mol/L、CaSO40.93 g、K2SO418.2 g、葡萄糖30 g、MgSO414.9 g、KOH 4.13 g、PTM 4.35 mL，氨水調(diào)pH至5.0。

BSMY培養(yǎng)基(1 L)：85% H3PO40.387 mol/L、CaSO40.93 g、K2SO418.2 g、葡萄糖30 g、MgSO414.9 g、KOH 4.13 g、PTM 4.35 mL，酵母提取物10 g，胰蛋白胨20 g，氨水調(diào)至pH 5.0。

補(bǔ)料培養(yǎng)基：葡萄糖儲液500 g/L和乳糖儲液200 g/L分別于滅菌鍋中121 ℃滅菌30 min，冷卻后加入4.35 mL/L PTM。

PBS緩沖液(1 L，含0.2 g疊氮鈉)：NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO41.4 g、KH2PO40.24 g、NaN30.2 g，調(diào)至pH 7.4，過濾除菌。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組乳酸克魯維酵母基因工程菌PN21高密度發(fā)酵

首先對10 L種子罐和100 L發(fā)酵罐分別進(jìn)行空消，然后在種子罐裝入4 L YDFM培養(yǎng)基，發(fā)酵罐裝入40 L BSM培養(yǎng)基，于121 ℃滅菌30 min，待培養(yǎng)基冷卻到30 ℃后，將提前搖好的1 L種子液接入種子罐，溫度30 ℃，攪拌速度500 r/min，通氣量7.5 m3/h，生長24 h后接入已滅菌的100 L發(fā)酵罐中，溫度30 ℃，pH 6.0，攪拌速度500 r/min，通氣量75 m3/h，生長24 h后開始流加葡萄糖使菌體密度增加，當(dāng)菌體濕重達(dá)到190 g/L時，開始流加乳糖誘導(dǎo)。誘導(dǎo)25 h后收獲產(chǎn)品，檢測抑菌活性并計(jì)算生物效價及蛋白產(chǎn)量。

1.2.2 抗菌肽生物效價及產(chǎn)量檢測

發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min離心2 min，0.22 μm濾膜過濾后，用打孔法做抑菌實(shí)驗(yàn)，每孔加入75 μL的抗菌肽測試樣品溶液，每個樣品3個重復(fù)。30 ℃培養(yǎng)2 d后，觀察抑菌圈大小并測量抑菌圈直徑，根據(jù)公式計(jì)算抗菌肽的生物效價。

生物效價/(U·L-1)=2x×1 000×16 700

x=(y-4)/2.1

式中：y抗菌圈抑菌直徑，mm(取平均值)；4為孔穴直徑，mm；2.1為抗菌肽濃度與抑菌圈直徑的比值常數(shù)。

蛋白產(chǎn)量/(mg·mL-1) = (1.45×A280-0.74×A260)×稀釋倍數(shù)

式中：A280和A260分別代表波長在280 nm和260 nm處的吸光值。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取誘導(dǎo)前時間間隔、乳糖流加量以及乳糖流加速度3個因素作試驗(yàn)因素，以抗菌肽產(chǎn)量為響應(yīng)值，采用Box-Behnken模型設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)[12]，因素編碼及各自變量水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used for Box-Behnken design

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Originpro 9.1和Design-Expert 8.0軟件處理數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化

超濾濃縮法：取50 mL離心(12 000 r/min，3 min)后的發(fā)酵液，依次用1、0.45、0.22 μm的濾膜抽濾，得到的上清液裝入100 kDa的超濾管離心(6 000 r/min，30 min)，將通過膜的液體再用30 kDa的超濾管超濾，后依次通過10 kDa和1 kDa超濾管超濾并濃縮。分別收集分子質(zhì)量在30～100 kDa、10～30 kDa、1～10 kDa和小于1 kDa的液體檢測抑菌活性。

丙酮沉淀法：取300 mL離心(12 000 r/min，3 min)后的發(fā)酵液，將上清液分成6份裝入三角瓶中，按照1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶9的比例加入丙酮溶液，4 ℃靜置 20 min，將上清液離心(4 ℃，12 000 r/min，2 min)后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將丙酮回收，收集殘留液體待檢測。將沉淀復(fù)融于無菌水中，保存?zhèn)溆谩?/p>

硫酸銨分級沉淀法：取200 mL發(fā)酵液離心(12 000 r/min，10 min)，將上清液分4份裝入已滅菌的三角瓶(250 mL)中。分別往4份上清液中加入硫酸銨固體，邊加邊攪拌至第1份硫酸銨終質(zhì)量濃度為200 g/L，第2份終質(zhì)量濃度為400 g/L，第3份終質(zhì)量濃度為600 g/L，第4份終質(zhì)量濃度為800 g/L，于4 ℃冰箱中靜置12 h，后離心(4 000 r/min，15 min)，棄上清保留沉淀。將沉淀溶于PBS中，充分溶解后裝入透析袋，4 ℃冰箱透析12 h。將透析液離心(12 000 r/min，5 min)，保存在干凈的三角瓶中，檢測抑菌活性。

Q-SepharoseTM-XL陰離子交換色譜法：按照說明書安裝好陰離子交換柱，用去離子水洗凈樹脂。再用3倍柱體積pH 7.0，20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液洗1次柱子。取50 mL離心(12 000 r/min，10 min)后的發(fā)酵液，分別用1、0.45、0.22 μm的濾膜抽濾，將抽濾后的液體上陰離子交換柱，分管收集流出液，保存?zhèn)溆茫?0 mL發(fā)酵液全部流出后，用3倍柱體積的磷酸鹽緩沖液沖洗柱子，收集流出液保存，接著用提前配制好的0.2、0.4、0.6、0.8、1 mol/L的NaCl溶液依次洗脫柱子，分管保存洗脫液。每個濃度NaCl洗完后均需用3倍柱體積的磷酸鹽緩沖液沖洗柱子。

1.2.6 SDS-PAGE檢測

對有活性的上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，分離膠質(zhì)量濃度為100 g/L，濃縮膠質(zhì)量濃度為50 g/L，上樣量20 μL，考馬斯亮藍(lán)R250染色，對電泳結(jié)果用凝膠成像儀成像。SDS-PAGE分析方法見參考文獻(xiàn)[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組抗菌肽PSI乳酸克魯維酵母基因工程菌高密度發(fā)酵

工程菌株在100 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)24 h后開始流加葡萄糖，使菌體密度增加，隨著發(fā)酵時間的增加，菌體密度不斷增大，當(dāng)酵母生長進(jìn)入穩(wěn)定期時(菌體濕重達(dá)到190 g/L)，開始流加乳糖誘導(dǎo)，誘導(dǎo)25 h后結(jié)束發(fā)酵，收獲發(fā)酵液80 L，菌體濕重達(dá)280 g/L。在乳糖誘導(dǎo)時每5 h取樣1次，第5 h時，發(fā)酵上清液中就可檢測到抗菌肽PSI蛋白，隨著誘導(dǎo)時間的增加蛋白表達(dá)量迅速增加(圖1)，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)25 h后，發(fā)酵液中抗菌肽效價達(dá)2.36×109U/L，成功實(shí)現(xiàn)了100 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽。SDS-PAGE結(jié)果表明：隨著誘導(dǎo)時間的增加，發(fā)酵液上清中蛋白表達(dá)量逐漸增加，到第25 h，表達(dá)產(chǎn)物量最多(圖2)。

圖1 細(xì)胞濕重曲線及PSI生物效價曲線
Fig.1 Curves of cell wet weight and activity of antimicrobial peptide

圖2 發(fā)酵液上清蛋白含量SDS-PAGE 檢測
Fig.2 SDS-PAGE for the targetprotein in the fermentation supernatant

2.2 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對抗菌肽表達(dá)量的影響

為研究YDFM和BSM誘導(dǎo)培養(yǎng)基對PN21菌株分泌表達(dá)抗菌肽PSI的影響，將PN21菌株分別在YDFM和BSM兩種鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)BSM培養(yǎng)基發(fā)酵后得到的抗菌肽抑菌圈直徑明顯大于經(jīng)YDFM培養(yǎng)基發(fā)酵所得肽的抑菌圈直徑(圖3)。在YDFMY和BSMY兩種培養(yǎng)基中(即在原培養(yǎng)基中添加酵母提取物和胰蛋白棟)，BSMY沒有明顯變化，而YDFMY中抗菌肽的表達(dá)量有所提高。YDFM、BSM、YDFMY和BSMY培養(yǎng)基中抗菌肽的效價分別為1.22×109、2.36×109、2.01×109和2.78×109U/L，BSMY、BSM和YDFMY中表達(dá)量相差不大。結(jié)果表明，BSM誘導(dǎo)培養(yǎng)基更適于重組工程菌表達(dá)抗菌肽，且更為經(jīng)濟(jì)和高效。

圖3 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對抗菌肽PSI產(chǎn)量的影響
Fig.3 Effects of fermentation media on the production of antibacterial peptide PSI

2.3 葡萄糖添加量、流加速度對菌體生長的影響

在菌體密度增長階段，準(zhǔn)確稱量10 kg葡萄糖，配制成500 g/L的溶液共20 L，以一定的流加速度(0.5 L/h)補(bǔ)料流加，分別在加入5 L(2.5 kg)、7 L(3.5 kg)、10 L(5 kg)、15 L(7.5 kg)和20 L(10 kg)時取樣檢測細(xì)胞濕重。以一定的葡萄糖添加量(5 kg)補(bǔ)料流加，設(shè)置0.3、0.5、1 L/h三組不同流加速度，每組實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行，待葡萄糖全部流加完后檢測細(xì)胞濕重。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，取平均值以確定酵母生長狀況。結(jié)果表明，細(xì)胞濕重隨葡萄糖的加入而迅速增加(圖4)，當(dāng)葡萄糖量達(dá)到7.5 kg時細(xì)胞濕重達(dá)到最大值240 g/L，繼續(xù)添加葡萄糖細(xì)胞濕重有所降低，這是由于發(fā)酵罐中葡萄糖積累，菌體密度過高，通氣量不足所造成的。葡萄糖流加速度為0.5 L/h時，罐內(nèi)的溶氧量能穩(wěn)定在35%左右，當(dāng)流加速度大于0.5 L/h，溶氧低于20%，由于供氧不足導(dǎo)致部分細(xì)胞無氧呼吸，影響抗菌肽的表達(dá)量。因此，單純地增加葡萄糖并不能實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵，培養(yǎng)基底物濃度要適當(dāng)，過量的葡萄糖還會出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象[14]。

圖4 葡萄糖添加量對菌體生長的影響
Fig.4 Effects of glucose addition on the cell growth

2.4 乳糖或半乳糖誘導(dǎo)對抗菌肽產(chǎn)量的影響

半乳糖作為乳酸克魯維酵母的誘導(dǎo)物，在誘導(dǎo)酵母表達(dá)抗菌肽時起至關(guān)重要的作用。但是考慮到發(fā)酵成本，半乳糖并不適合大量使用，為了確定乳糖是否可作為半乳糖的替代品，將一定量的乳糖和半乳糖分別作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)酵母表達(dá)抗菌肽PSI，在不同誘導(dǎo)物下發(fā)酵液中抗菌肽效價分別為2.36×109和3.28×109U/L，從而確定乳糖也可作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)酵母表達(dá)抗菌肽。

2.5 誘導(dǎo)重組菌抗菌肽表達(dá)條件的優(yōu)化

2.5.1 誘導(dǎo)前時間間隔對抗菌肽產(chǎn)量的影響

在添加誘導(dǎo)物之前，發(fā)酵罐中的葡萄糖是否消耗徹底，直接影響重組菌對外源蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了0、0.5、1、1.5和2 h五個誘導(dǎo)前時間間隔，在乳糖添加量和流加速度相同的情況下比較發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中抗菌肽效價。結(jié)果表明，隨著誘導(dǎo)前時間間隔的延長，發(fā)酵液中抗菌肽的效價不斷增大，1 h的時間間隔獲得了最大1.22×109U/L抗菌肽效價，說明發(fā)酵罐中的葡萄糖消耗徹底。當(dāng)誘導(dǎo)前時間間隔延長至1.5 h后，抗菌肽的效價出現(xiàn)下降，表明當(dāng)葡萄糖消耗完以后，部分酵母因缺乏營養(yǎng)進(jìn)入休眠狀態(tài)或出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象，導(dǎo)致誘導(dǎo)率降低(圖5)。因此，最佳誘導(dǎo)前時間間隔以1 h為宜。

圖5 誘導(dǎo)前時間間隔對抗菌肽產(chǎn)量的影響
Fig.5 Effects of fermentation time before induction on activity of antimicrobial peptide

2.5.2 乳糖添加量、流加速度對抗菌肽產(chǎn)量的影響

在誘導(dǎo)階段，準(zhǔn)確稱量6 kg乳糖，配制成200 g/L的溶液共30 L，以一定的流加速度(1 L/h)補(bǔ)料流加，分別在流入15 L(3 kg)、20 L(4 kg)、25 L(5 kg)、30 L(6 kg)時取樣檢測抗菌肽的生物效價。以一定的乳糖添加量(5 kg)補(bǔ)料流加，設(shè)置0.5、1、1.5和2 L/h四組不同流加速度，每組實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行，待乳糖全部流加完后檢測抗菌肽的生物效價，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。結(jié)果表明，隨著乳糖添加量和流加速度的增加，發(fā)酵液中抗菌肽的效價不斷增大，當(dāng)乳糖添加量大于25 L時，抗菌肽的效價有所下降(圖6-a)，原因可能是隨著代謝產(chǎn)物的積累，產(chǎn)生的降解酶使抗菌肽降解所致[15]。說明25 L乳糖能誘導(dǎo)表達(dá)肽的量達(dá)到最大化。當(dāng)乳糖流加速度為1 L/h時，發(fā)酵液中抗菌肽的效價達(dá)到最大，乳糖流加速度大于1 L/h發(fā)酵液中抗菌肽的效價反而有下降(圖6-b)，主要原因是在提高流加速度條件下，導(dǎo)致發(fā)酵罐內(nèi)乳糖積累，溶氧急劇下降，細(xì)胞表達(dá)抗菌肽受到抑制且會進(jìn)行無氧呼吸，進(jìn)而使肽產(chǎn)量下降。因此，乳糖添加量為25 L且流加速度為1 L/h時，酵母表達(dá)抗菌肽的量最高。

圖6 乳糖添加量、流加速度對抗菌肽產(chǎn)量的影響
Fig.6 Effects of lactose addition and flow acceleration on production of antimicrobial peptide

2.6 重組菌抗菌肽表達(dá)條件的響應(yīng)面法優(yōu)化

2.6.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

在進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)時，以誘導(dǎo)前時間間隔(A)、乳糖流加量(B)以及乳糖流速(C)作為自變量，以抑菌圈直徑為響應(yīng)值(Y)，共17個試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個為析因點(diǎn)，5 個為中心點(diǎn)，中心點(diǎn)重復(fù)的目的是估計(jì)整個試驗(yàn)的純試驗(yàn)誤差。各因素對誘導(dǎo)抗菌肽PSI表達(dá)量的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表2。

2.6.2 模型的建立與顯著性分析

利用Design-Expert 8.0軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到抗菌肽PSI抑菌活性的二次多元回歸方程：Y=2.53+0.23A-0.056B+0.087C+0.037AB+0.20AC-0.10BC-0.92A2-0.40B2-0.43C2

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experiment design and result forresponse surface analysis

由方差分析得出表3的結(jié)果，從p值可以看出，模型極顯著(p<0.01)，說明回歸方程可以很好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，失擬項(xiàng)p=0.357 8>0.05不顯著，表明試驗(yàn)結(jié)果與數(shù)學(xué)模型擬合程度良好，可用該模型來分析和預(yù)測抗菌肽PSI的發(fā)酵工藝條件，相關(guān)系數(shù)R2=0.987 6，表明98.76%的數(shù)據(jù)可用此方程解釋。預(yù)測值與實(shí)測值之間有較好的相關(guān)性?；貧w方程中各變量對響應(yīng)值影響的顯著性，由F檢驗(yàn)法判定，概率p值越小，則相應(yīng)變量的顯著性程度越高。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

從回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，一次項(xiàng)誘導(dǎo)時間間隔(A)，二次項(xiàng)誘導(dǎo)時間間隔(A2)、乳糖流加量(B2)、乳糖流加速度(C2)及誘導(dǎo)時間間隔和乳糖流加速度的交互項(xiàng)(AC)對抗菌肽PSI表達(dá)量影響極顯著(p<0.01)，一次項(xiàng)乳糖流加速度(C)對抗菌肽PSI表達(dá)量影響顯著(0.01

2.6.3 響應(yīng)面交互作用分析

由圖7、圖8、圖9響應(yīng)面立體圖和等高線圖形可知：誘導(dǎo)前時間間隔與乳糖添加量、誘導(dǎo)前時間間隔和乳糖流加速度的交互作用對抗菌肽的產(chǎn)量影響均顯著；圖9-b中等高線圖形趨于圓形，表明乳糖添加量與流加速度兩因素交互作用不顯著。

圖7-a響應(yīng)面圖隨著誘導(dǎo)前時間間隔的增加，抗菌肽的產(chǎn)量先增后減，且變化幅度較大；隨著乳糖添加量的增加，抗菌肽的產(chǎn)量先增后減，變化幅度較小。這主要由于誘導(dǎo)前時間間隔較小時，發(fā)酵罐內(nèi)的葡萄糖沒有完全消耗，酵母會優(yōu)先利用葡萄糖繁殖而不會產(chǎn)肽；隨著誘導(dǎo)前時間間隔的延長，發(fā)酵罐中的葡萄糖被消耗，在只有乳糖存在的條件下，酵母誘導(dǎo)啟動子打開，才能誘導(dǎo)表達(dá)抗菌肽；誘導(dǎo)前時間間隔過長時，發(fā)酵罐中的葡萄糖消耗完后培養(yǎng)基中缺乏營養(yǎng)，酵母相互競爭出現(xiàn)衰亡的現(xiàn)象，因而抗菌肽產(chǎn)量也較低。

圖7 誘導(dǎo)前時間間隔和乳糖添加量對抗菌肽產(chǎn)量的響應(yīng)面和等高線
Fig.7 Curvedsurface of response and contour lines of time interval before induction and lactose addition to production of antimicrobial peptide

圖8-a可以看出，抗菌肽產(chǎn)量均隨誘導(dǎo)前時間間隔和乳糖流加速度的增加，先增大再降低?？咕漠a(chǎn)量隨乳糖流加速度的變化是由于，起初流速較小時，不足以誘導(dǎo)所有酵母表達(dá)，隨著流速增大，乳糖量充足，所有酵母表達(dá)量達(dá)最佳狀態(tài)；繼續(xù)加大流速，酵母來不及利用的部分乳糖在罐內(nèi)積累，使得罐內(nèi)溶氧急劇下降，當(dāng)溶氧量低于20%時，酵母進(jìn)行無氧呼吸，停止表達(dá)抗菌肽，因而抗菌肽產(chǎn)量也較低。

圖8 誘導(dǎo)前時間間隔和乳糖流加速度對抗菌肽產(chǎn)量的響應(yīng)面和等高線
Fig.8 Curvedsurface of response and Contour lines of time interval before induction and lactose flow acceleration to production of antimicrobial peptide

圖9 乳糖添加量和流加速度對抗菌肽產(chǎn)量的響應(yīng)面和等高線
Fig.9 Curvedsurface of response and Contour lines of lactose addition and flow acceleration to production of antimicrobial peptide

2.6.4 最優(yōu)工藝條件及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由各響應(yīng)面立體圖可看出，響應(yīng)值存在最大值。通過Design-Expert 8.0 軟件對試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行分析計(jì)算得出理論最佳發(fā)酵工藝：誘導(dǎo)前時間間隔1.14 h、乳糖流加量4.92 kg、乳糖流加速度1.07 L/h，模型預(yù)測的抗菌肽PSI生物效價的極大值為1.45×1010U/L。在此條件下進(jìn)行2次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，抗菌肽PSI表達(dá)量1.04×1010U/L，與理論預(yù)測值接近，說明該方程與實(shí)際情況的擬合性良好。因此，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的工藝優(yōu)化條件可行，參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價值。

2.7 發(fā)酵液中抗菌肽PSI的分離純化

硫酸銨沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)硫酸銨濃度為60%和80%時，發(fā)酵液沉淀中的抗菌肽PSI抑菌活性較強(qiáng)(圖10-A)，說明當(dāng)硫酸銨濃度大于60%時，抗菌肽完全沉淀。陰離子柱分離結(jié)果表明，當(dāng)用不同濃度的NaCl溶液對結(jié)合到陰離子柱上的抗菌肽PSI進(jìn)行洗脫，鹽濃度為0.2 mmol/L和0.4 mmol/L洗脫后抑菌效果較好(圖10-B)。超濾純化結(jié)果表明，當(dāng)截留的蛋白分子量在10～30 kDa和30～100 kDa時抑菌效果最強(qiáng)，該結(jié)果與前人對乳酸克魯維酵母表達(dá)抗菌肽PSI的研究結(jié)果相符，在截留蛋白分子量為30～100 kDa處出現(xiàn)抑菌效果是抗菌肽糖基化后的結(jié)果[16]，有待進(jìn)一步研究。分子量小于1 kDa時完全沒有抑菌活性(圖10-C)。丙酮沉淀純化結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵液與丙酮比為1∶8和1∶9時，重溶于水的沉淀具有抑菌活性而上清液中無抑菌效果，說明發(fā)酵液與丙酮比大于1∶8抗菌肽被完全沉淀(圖10-D)。SDS-PAGE分析表明，4種不同的分離純化方法均在蛋白分子量為17 kDa處出現(xiàn)了明顯的條帶，與發(fā)酵液相比，陰離子柱和丙酮沉淀兩種方法能夠去除大部分雜蛋白，純化效果較好(圖11泳道2，5)，其次是超濾法，在截留蛋白分子量為10～30 kDa處出現(xiàn)了如圖11泳道4的結(jié)果，超濾最主要的目的是去除小分子物質(zhì)并將樣品濃縮，硫酸銨分級沉淀法純化后，除了目的蛋白外，依然存在明顯的雜蛋白(圖11泳道3)。因此，這些方法均能在不同程度上將抗菌肽PSI提純。

圖10 不同純化方法抑菌活性檢測
Fig.10 Purificationof antimicrobial peptides PSI

1-發(fā)酵液；2-陰離子柱；3-硫酸銨分級沉淀；4-超濾濃縮；5-丙酮沉淀
圖11 抗菌肽PSI純化檢測
Fig.11 Detection of purified antimicrobial peptides PSI

3 結(jié)論與討論

抗菌肽PSI作為一種霉菌抑制劑，對多種霉菌具有一定的拮抗作用，尤其是對一些易使水果和食物變質(zhì)發(fā)霉的真菌具有很好的抗性，抗菌肽PSI有望成為一種新型防腐劑。高密度發(fā)酵是基因工程菌提高外源蛋白表達(dá)水平的一種重要策略，乳酸克魯維酵母高密度發(fā)酵表達(dá)外源蛋白是工業(yè)化生產(chǎn)重組蛋白的重要途徑，目前已有多種重組蛋白通過乳酸克魯維酵母高密度發(fā)酵。酵母工程菌株的發(fā)酵主要分為3個階段: 第1階段，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長；第2階段，流加葡萄糖階段，此階段菌體密度迅速增長；第3階段，使用乳糖作為碳源進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，此時蛋白開始大量表達(dá)，耗氧量迅速增加。

本研究在成功將抗菌肽PSI基因重組至乳酸克魯維酵母中并建立基因工程菌的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了重組抗菌肽PSI基因在乳酸克魯維酵母中高效表達(dá)。經(jīng)發(fā)酵工藝優(yōu)化后，在10～100 L雙聯(lián)半自動發(fā)酵罐中，菌體細(xì)胞濕重達(dá)到280 g/L，誘導(dǎo)25h后抗菌肽效價達(dá)到2.36×109U/L，蛋白產(chǎn)量達(dá)27.8 mg/L，并且通過SDS-PAGE 驗(yàn)證目的蛋白正確表達(dá)。CURTO等人[2]用乳酸克魯維酵母分泌表達(dá)抗菌肽PSI，產(chǎn)量為4 mg/L。相比前人的發(fā)酵方法，本研究通過發(fā)酵罐發(fā)酵抗菌肽，發(fā)酵液上清中抗菌肽的產(chǎn)量大約提高到前人報道的7倍。對比分析表明利用發(fā)酵罐發(fā)酵能夠提高抗菌肽產(chǎn)量的原因是：發(fā)酵過程可以人為控制溶氧、pH及誘導(dǎo)過程，避免了搖瓶發(fā)酵通氣量不足、酵母自身代謝產(chǎn)酸對肽造成降解以及誘導(dǎo)物濃度不定等問題，發(fā)酵罐發(fā)酵可以保證酵母的整個生長和代謝過程均處于最佳的狀態(tài)，從而使蛋白產(chǎn)量達(dá)到最大化。

SDS-PAGE 的結(jié)果表明在蛋白分子量為17 kDa和100 kDa左右處發(fā)現(xiàn)特異性的蛋白條帶隨著誘導(dǎo)時間的延長逐漸增加。該結(jié)果與前人對乳酸克魯維酵母表達(dá)抗菌肽的研究結(jié)果相符，所以推測這條100 kDa的特異蛋白條帶為糖基化后的抗菌肽PSI[16]。前人對抗菌肽進(jìn)行直接提純研究，發(fā)現(xiàn)這些抗菌肽具有非常高的比活且具有高分子量的糖基化修飾[2,17]。這也表明高分子量糖基化修飾是影響高效率表達(dá)抗菌肽PSI的關(guān)鍵。

對于生物大分子的分離，只使用單一的方法很難將待分離物質(zhì)完全分離，通常將幾種原理不同的技術(shù)組合起來以獲得理想的純化效果[18]。其中超濾濃縮去除了部分小分子雜質(zhì)及色素，成本低，可處理大量樣品；陰離子交換色譜可有效的去除大量色素及雜蛋白，具有載量大、分辨率好、流速高等優(yōu)點(diǎn)。

本研究實(shí)現(xiàn)了抗菌肽PSI在發(fā)酵罐中的高效表達(dá)，并且討論了不同純化方法對抗菌肽提純的效率，通過對抗菌肽PSI在100 L發(fā)酵罐中發(fā)酵成功，離將來果蔬保鮮以及植物防止病原菌入侵方面的應(yīng)用又更近了一步，然而要將其開發(fā)成為新一代的食品防腐劑，還需對其生物學(xué)活性和毒性特征進(jìn)行進(jìn)一步的考察和確定。