摻鍶透鈣磷石骨水泥修復(fù)骨質(zhì)疏松家兔牙槽骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

方俊 董偉 彭宏峰 徐艷麗 賈婉萍 梁立碩 梁永強(qiáng)

華北理工大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院1正畸科，2頜面外科（河北唐山 063000）

2000年我國(guó)衛(wèi)生部門的統(tǒng)計(jì)顯示，我國(guó)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率占全國(guó)總?cè)丝诘?%左右。有研究顯示，骨質(zhì)疏松患者發(fā)生骨折的概率高且愈合更加困難［1］。與正常骨組織相比，骨質(zhì)疏松患者的成骨細(xì)胞的數(shù)量和活性均有降低，骨缺損修復(fù)較慢［2］。

透鈣磷石復(fù)合材料是一種具有良好生物相容性和成骨作用的骨修復(fù)材料，但因其降解速度過快，常導(dǎo)致骨修復(fù)作用并不明顯。鍶可以影響骨基質(zhì)的形成，促進(jìn)新骨生成，并且鍶還可以抑制骨的吸收［3-4］。將鍶元素加入透鈣磷石中，利用透鈣磷石良好的溶解性可以將鍶元素很好地釋放到缺損部位，從而促進(jìn)骨缺損的愈合。實(shí)驗(yàn)將探究摻鍶5%透鈣磷石骨水泥對(duì)骨質(zhì)疏松家兔骨缺損的修復(fù)效果，以期在修復(fù)中能起到一定的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康成年雌性家兔18只，體質(zhì)量2.5～2.7 kg，由華北理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，隨機(jī)分為3組，分別為空白對(duì)照組、透鈣磷石組和摻鍶5%透鈣磷石組，每組各6只。所有實(shí)驗(yàn)操作均遵循動(dòng)物倫理委員和管理委員會(huì)的規(guī)定。

1.1.2 主要試劑二水合磷酸氫鈣，碳酸鈣，無水乙醇，磷酸二氫鈣，焦磷酸鈉，氯化鍶，乙醇酸。

1.2 方法

1.2.1 骨水泥的制備將250 g二水合磷酸氫鈣和72.7 g碳酸鈣充分溶解于500 mL超純水中，樣品充分干燥后研磨，在1 100℃的馬弗爐中煅燒10 h。將煅燒后的樣本以無水乙醇為介質(zhì)充分研磨，將分散液離心除去乙醇，在60℃的烘干箱中干燥48 h，將樣本磨碎得到β?磷酸三鈣粉末。用β?磷酸三鈣、磷酸二氫鈣和焦磷酸鈉制備成透鈣磷石骨水泥，以鍶/（鍶+鈣）為10%在透鈣磷石中加入氯化鍶制得摻鍶5%透鈣磷石骨水泥，將制得的骨水泥在模具中固化定型，24 h后取出，紫外線消毒備用。

1.2.2 骨質(zhì)疏松模型的制備用2 mL/kg的水合氯醛從耳緣靜脈給藥進(jìn)行麻醉，在無菌環(huán)境下，從腹白線處切開腹膜約2 cm，在子宮上方尋找兩側(cè)卵巢，切除兩側(cè)卵巢，關(guān)閉腹腔，傷口撒青霉素。術(shù)后每日肌注青霉素160萬U。術(shù)后1周，骨質(zhì)疏松組開始肌注地塞米松，0.5 mg/kg，每周2次，共8周。

1.2.3 骨水泥的植入用2 mL/kg的水合氯醛從耳緣靜脈給藥進(jìn)行麻醉，在無菌環(huán)境下沿兔口角下緊貼下頜骨上緣、口角后10 mm處皮膚，向磨牙方向做一長(zhǎng)約20 mm的切口，暴露下頜骨骨面用低速手機(jī)在頦孔前1 mm處做一長(zhǎng)10 mm、寬4 mm、高3 mm的骨缺損，取消毒好的骨水泥塊，生理鹽水沖洗后置于骨缺損處，縫合傷口，術(shù)后3 d每日肌注青霉素40萬U［5］。

1.2.4 觀察指標(biāo)和方法（1）骨質(zhì)疏松模型的測(cè)定：隨機(jī)選取9只家兔用于骨密度的測(cè)量，分別在術(shù)前3 d、術(shù)后8、12周進(jìn)行家兔腰椎骨密度（bone mineral density，BMD）的測(cè)量。術(shù)后BMD小于術(shù)前BMD減去2倍標(biāo)準(zhǔn)差則表示造模成功［6］。（2）骨損修復(fù)的測(cè)定：于術(shù)后4、8周處死各組動(dòng)物3只，分離取出下頜骨，生理鹽水沖洗，于固定液中固定12 h后拍攝X線片，觀察骨缺損的修復(fù)情況。將分離的下頜骨完全浸入脫鈣液中，每3天更換一次脫鈣液，4℃下保存8周，充分清洗后，常規(guī)石蠟包埋、切片。免疫組化觀察b?FGF的表達(dá)，用Image?Pro Plus6.0軟件測(cè)量各組的光密度值（MOD值）進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0分析數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 骨質(zhì)疏松模型的建立BMD結(jié)果顯示術(shù)前3 d、術(shù)后8、12周家兔BMD值有差異（P＜0.05）；12周時(shí)術(shù)后BMD小于術(shù)前BMD減去2倍標(biāo)準(zhǔn)差，提示造模成功。

2.2 X線表現(xiàn)根據(jù)新骨形成的X線評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)修復(fù)情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，計(jì)算各組的平均得分［7］，新生骨占缺損底部到頂部距離的0%～25%，記1分；新生骨占缺損底部到頂部距離的26%～50%，記2分；新生骨占缺損底部到頂部距離的51%～75%，記3分；新生骨占缺損底部到頂部距離的76%～100%，記4分；未見新生骨生成，記0分。術(shù)后4周，空白組呈明顯的缺損低密度影，平均得分0；透鈣磷石組缺損區(qū)可見明顯的高密度塊狀影，為骨水泥未吸收影像，有少量新生骨生成，平均得分0.3；5%摻鍶透鈣磷石組缺損區(qū)有霧狀高密度影出現(xiàn)，提示骨水泥大部分溶解，可見缺損底部有新骨生成，平均得分1。術(shù)后8周，空白組缺損區(qū)域修復(fù)呈淺凹坑狀，平均得分1.7；透鈣磷石組缺損區(qū)大部分修復(fù)，缺損表面有凹陷，平均得分3.2；5%摻鍶透鈣磷石組缺損區(qū)基本修復(fù)，可見明顯的骨小梁結(jié)構(gòu)，平均得分4。見圖1、2。2.3 免疫組化結(jié)果利用Image?Pro Plus 6.0分析得出其MOD值來評(píng)價(jià)其陽性率。4周時(shí)，3組的陽性表達(dá)率均較高，5%摻鍶透鈣磷石組＞透鈣磷石組＞空白組，空白組缺損邊緣有少量的成纖維細(xì)胞；透鈣磷石組缺損區(qū)有成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞聚集；5%摻鍶透鈣磷石組中可見大量的成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。8周時(shí)，3組陽性表達(dá)率有所降低，5%摻鍶透鈣磷石組＞透鈣磷石組＞空白組，空白組未見新骨形成；透鈣磷石組有骨小梁存在，周圍有少量基質(zhì)呈陽性表達(dá)；5%摻鍶透鈣磷石組有骨性結(jié)構(gòu)存在，b-FGF陽性表達(dá)部位較少。見圖3、4、表1。

圖1 4周時(shí)3組X線結(jié)果Fig.1 The X?ray results of the 3 groups at 4 weeks

圖2 8周時(shí)3組X線結(jié)果Fig.2 The X?ray results of the 3 groups at 4 weeks

圖3 4周時(shí)3組b?FGF的表達(dá)情況（× 200）Fig.3 The expression of the 3 groups of b?FGF at 4 weeks（× 200）

圖4 8周時(shí)3組b?FGF的表達(dá)情況（× 200）Fig.4 The expression of the 3 groups of b?FGF at 8 weeks（× 200）

3 討論

透鈣磷石骨水泥是臨床常用的一種骨修復(fù)材料，具有良好的生物相容性、溶解性和生物活性［8］。本實(shí)驗(yàn)為了能夠同時(shí)觀察骨水泥的溶解情況和新骨的生成情況，從而判斷摻鍶透鈣磷石在體內(nèi)是否會(huì)加速溶解，并且能夠促進(jìn)新骨的生成，故采用X線片來觀察缺損區(qū)的修復(fù)情況。黃旋平等［9］的實(shí)驗(yàn)說明了通過X線評(píng)判新生骨的可行性。ZHAO等［7］的實(shí)驗(yàn)提供了一種通過X線評(píng)判新生骨的方法。實(shí)驗(yàn)中X線片結(jié)果顯示：4周時(shí)，透鈣磷石組骨水泥基本未溶解吸收，而5%摻鍶透鈣磷石組骨水泥大部分溶解吸收，且新骨生成的量平均要大于透鈣磷石組，說明在加入5%的鍶后，透鈣磷石的溶解性更好。原因可能是鍶元素和鈣元素相近，但離子半徑要大于鈣離子，透鈣磷石中的鈣被鍶替換后，其單位體積變大，原有晶格發(fā)生畸變，從而改變?cè)胁牧系慕Y(jié)晶性和生物降解性，所以摻鍶透鈣磷石的降解性會(huì)更好，更有利于骨組織的修復(fù)［11，17］。8周時(shí)，5%摻鍶透鈣磷石組的骨修復(fù)能力優(yōu)于透鈣磷石組，原因可能是加入鍶元素后的透鈣磷石骨水泥溶解速度加快，鍶元素被大量釋放，而鍶元素具有增強(qiáng)前成骨細(xì)胞的復(fù)制和成骨細(xì)胞的功能性活動(dòng)，并且可以抑制破骨細(xì)胞的吸收，從而促進(jìn)了新骨的形成［12，18］。LUO等［10］的實(shí)驗(yàn)表明摻鍶透鈣磷石骨水泥在體外模擬實(shí)驗(yàn)中有很好的溶解性，且能誘導(dǎo)新骨的生成。本實(shí)驗(yàn)表明摻鍶透鈣磷石骨水泥在動(dòng)物體內(nèi)也能有很好的溶解性和誘導(dǎo)新骨形成，為以后臨床的應(yīng)用提供了進(jìn)一步的依據(jù)。

表1 各組b?FGF陽性表達(dá)部位MOD值的比較Tab.1 Comparison of MOD values of positive expression sites of b?FGF in each group（n=3） ±s

表1 各組b?FGF陽性表達(dá)部位MOD值的比較Tab.1 Comparison of MOD values of positive expression sites of b?FGF in each group（n=3） ±s

注：與空白組比較，*P＜0.05；與透鈣磷石組比較，#P＜0.05

組別空白組透鈣磷石組5%摻鍶透鈣磷石組F值P值4周0.166 5±0.019 3 0.208 2±0.018 2*0.243 6±0.015 1*#75.008＜0.001 8周0.136 7±0.018 7 0.158 7±0.015 4*0.184 7±0.017 6*#37.924＜0.001

b?FGF是人體內(nèi)重要的生長(zhǎng)因子之一，可由骨髓基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞等分泌，儲(chǔ)存于細(xì)胞外基質(zhì)中［13］。實(shí)驗(yàn)4、8周時(shí)，5%透鈣磷石組中的b?FGF陽性表達(dá)率均高于其他兩組，可能原因是鍶元素促進(jìn)成骨細(xì)胞的生成，成骨細(xì)胞分泌大量的b?FGF，而b?FGF通過刺激毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，促進(jìn)毛細(xì)血管的形成，缺損區(qū)大量毛細(xì)血管的生成，又給其帶來豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和鈣元素，供其修復(fù)，且還可以帶來大量的間充質(zhì)細(xì)胞，間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞，參與新骨的形成［14，16］。這可能就是免疫組化結(jié)果中觀察到大量血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的原因。在8周時(shí)，5%摻鍶透鈣磷石組的b?FGF的陽性表達(dá)率較4周時(shí)要低，原因可能是8周時(shí)新骨趨于成熟，其中的毛細(xì)血管會(huì)相應(yīng)減少，成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞活動(dòng)減少，導(dǎo)致了b?FGF的陽性表達(dá)率有所降低。有學(xué)者認(rèn)為b?FGF在缺損修復(fù)的后期會(huì)失去作用［15］，但實(shí)驗(yàn)中8周時(shí)5%摻鍶透鈣磷石組的陽性表達(dá)率依舊較其他兩組高，說明鍶元素在修復(fù)的后期依舊能對(duì)骨質(zhì)疏松骨缺損的修復(fù)起到一定的促進(jìn)作用。

總之，5%摻鍶透鈣磷石可以很好地修復(fù)骨質(zhì)疏松家兔下頜骨的缺損，為骨質(zhì)疏松骨缺損的修復(fù)提供了一些借鑒價(jià)值，其可能原因是促進(jìn)了b?FGF的大量生成，但未從分子機(jī)制方面得到印證，今后的實(shí)驗(yàn)可以從具體的信號(hào)途徑進(jìn)行更深入的研究。

［1］GOURLAY M L，OVERMAN R A，F(xiàn)INE J P，et al.Time to Osteoporosis and Major Fracture in Older Men：The MrOS Study［J］.Am J Prevent Med ，2016，50（6）：727?736.

［2］COIPEAU P，ROSSET P，LANGONNE A，et al.Impaired dif?ferentiation potential of human trabecular bone mesenchymal stromal cells from elderly patients［J］.Cytotherapy，2009，11（5）：584.

［3］CHOUDHARY S，HALBOUT P，ALANDER C，et al.Stron?tium Ranelate Promotes Osteoblastic Differentiation and Miner?alization of Murine Bone Marrow Stromal Cells：Involvement of Prostaglandins［J］.J Bone Miner Res，2007，22（7）：1002?1010.

［4］FONSECA J E.Rebalancing bone turnover in favour of forma?tion with strontium ranelate：implications for bone strength［J］.Rheumatology，2008，47（4）：17?19.

［5］榮子杰，楊聯(lián)軍，張贊杰，等.載ADM?PLGA微球的納米羥基磷灰石/膠原支架修復(fù)兔骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2014，30（22）：3559?3562.

［6］ZHANG Z，REN H，SHEN G，et al.Animal models for gluco?corticoid?induced postmenopausal osteoporosis：An updated re?view.［J］.Biomed Pharmacother，2016，84：438?446.

［7］ZHAO M D，HUANG J S，ZHANG X C，et al.Construction of radial defect models in rabbits to determine the critical size De?fects［J］.PLoS One，2016，11（1）：e0146301.

［8］ALGE D L，GOEBEL W S，CHU T M.Effects of DCPD ce?ment chemistry on degradation properties and cytocompatibili?ty：comparison of MCPM/β ?TCP and MCPM/HA formulations［J］.Biomed Mater，2013，8（2）：025010.

［9］黃旋平，周諾，楊媛媛，等.hBMP?2基因修飾自體BMSCs移植促進(jìn)兔下頜骨牽張成骨新骨形成的X線分析［J］.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（4）：457?460.

［10］LUO X，BARBIERI D，ZHANG Y，et al.Strontium?Contain?ing Apatite/Poly lactide composites favoring osteogenic differen?tiation and in vivo bone formation［J］.Acs Biomater Sci Eng，2015，1（2）：150126133543001.

［11］ALKHRAISAT M H，RUEDA C，CABARCOS E L.Strontium ions substitution in brushite crystals：the role of strontium chlo?ride［J］.J Funct Biomat，2011，2（2）：31?38.

［12］SCHUMACHER M，WAGNER A S，KOKESCH?HIMMEL?REICH J，et al.Strontium substitution in apatitic CaP cements effectively attenuates osteoclastic resorption but does not inhibit osteoclastogenesis［J］.Acta Biomaterialia，2016，37：184?194.

［13］NISSEN N N，GAMELLI R L，POLVERINI P J，et al.Differ?ential angiogenic and proliferative activity of surgical and burn wound fluids［J］.J Trauma Acute Care Surg，2003，54（6）：1205?1210.

［14］尹飚，蘇增貴，彭杰，等.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子影響兔成骨細(xì)胞增殖與分化的實(shí)驗(yàn)研究［J］.廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，29（1）：22?25.

［15］RIVERA J C，STROHBACH C A，WENKE J C，et al.Beyond osteogenesis：anin vitrocomparison of the potentials of six bone morphogenetic proteins［J］.Front Pharmacol，2013，4：125.

［16］EL BACKLY R M，ZAKY S H，MURAGLIA A，et al.A plate?let?rich plasma?based membrane as a periosteal substitute with enhanced osteogenic and angiogenic properties：a new concept for bone repair［J］.Tissue Engineering Part A，2013，19（1?2）：152.

［17］TAHA A，AKRAM M，JAWAD Z，et al.Strontium doped in?jectable bone cement for potential drug delivery applications［J］.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2017，80：93?101.

［18］SINGH S S，ROY A，LEE B，et al.Murine osteoblastic and os?teoclastic differentiation on strontium releasing hydroxyapatite forming cements［J］.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2016，63：429?438.