金黃色葡萄球菌腸毒素P雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立

杜玄，趙燕英，劉驥，龍虎，王洪志，田萬(wàn)帆，唐俊妮

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種重要的病原菌，極易污染食品并引發(fā)食物中毒，以及人或動(dòng)物的組織感染、敗血癥和肺炎等[1,2]。在我國(guó)，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占所有細(xì)菌性食物中毒的比例高達(dá)20%～25%[3]。金黃色葡萄球菌引發(fā)的食物中毒主要是由腸毒素引起的。目前已發(fā)現(xiàn)的金黃色葡萄球菌腸毒素有 22種，根據(jù)其被發(fā)現(xiàn)的先后順序，分別命名為傳統(tǒng)腸毒素SEA～SEE和新型腸毒素SEG-SET，SElU，SElU2，SElV[4]。

對(duì)于新發(fā)現(xiàn)的腸毒素目前還缺乏檢測(cè)方法?，F(xiàn)有的檢測(cè)金黃色葡萄球菌傳統(tǒng)腸毒素和部分新型腸毒素的方法有分子生物學(xué)檢測(cè)法、免疫學(xué)檢測(cè)法和生物傳感器法等[5]，其中，大多是針對(duì)毒素基因水平的檢測(cè)，如Letertre等[6]利用實(shí)時(shí)熒光PCR（polymerase chain reaction）成功檢測(cè)出了9種腸毒素基因，該檢測(cè)技術(shù)快速，但只能檢測(cè)核酸水平而不能檢測(cè)蛋白本身。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是依靠抗原決定簇與抗體結(jié)合位點(diǎn)之間特異性進(jìn)行檢測(cè)，如 Rahimi等[7]用ELISA方法檢測(cè)食品中的傳統(tǒng)腸毒素SEA-SED；Nagaraj等[8]利用雙抗夾心 ELISA（double-antibody sandwich-enzyme linked immunosorbent assay，DAS-ELISA）的方法檢測(cè)食品中的SEG；朱安妮等[9]利用雙抗夾心 ELISA建立檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素SEI；Zhao等[10]利用雙抗夾心ELISA檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素SEM。但目前還未見(jiàn)檢測(cè)新型腸毒素SEP的ELISA方法報(bào)道。

新型腸毒素 sep基因的核苷酸序列有 729 bp（NCBI登錄號(hào)：YP_009113107.1），編碼286個(gè)氨基酸殘基的毒素蛋白SEP，分子量為27.89 ku。Hait等[11]在發(fā)生食物中毒事件的面包店中，檢測(cè)出金黃色葡萄球菌新型腸毒素sep基因。Calderwood等[12]的研究發(fā)現(xiàn)攜帶sep基因的MRSA菌株會(huì)增加敗血癥的風(fēng)險(xiǎn)。因此，研究腸毒素SEP的夾心ELISA檢測(cè)方法具有必要性，可為食品污染腸毒素SEP的風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SEP蛋白純品（1.8 mg/mL），SEP單克隆抗體（2.3 mg/mL），抗SEP兔血清（1.57 mg/mL），以及SEK、SEI和SEM蛋白均為本實(shí)驗(yàn)室自制；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 IgG（IgG/HRP）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物溶液購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；Tween-20購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；脫脂奶粉購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板購(gòu)自中國(guó)Costar公司；Elx-808型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SEP的DAS-ELISA工作流程

以適當(dāng)稀釋的SEP單克隆抗體包被酶標(biāo)板，每孔100 μL，4 ℃包被過(guò)夜；倒出包被液，每孔加入含有Tween-20的磷酸鹽緩沖液（PBST），清洗3次；隨后，每孔加入200 μL的5%脫脂乳的磷酸鹽緩沖液（PBS），37 ℃封閉1～2 h，洗板3次；再加入SEP純品蛋白（20 μg/mL），每孔 100 μL，37 ℃孵育 45～90 min；加入抗SEP兔血清，100 μL/孔，37 ℃孵育 1 h；以羊抗兔IgG/HRP 為二抗，100 μL/孔，37 ℃孵育 30～60 min；洗板5次，加入TMB底物顯色溶液，每孔100 μL，避光顯色10～20 min；加入2 mol/L的硫酸溶液使反應(yīng)停止。測(cè)定450 nm處的OD值，并計(jì)算P/N值（其中P為檢測(cè)樣品的OD450nm值；N為陰性對(duì)照OD450nm值）。

1.2.2 最佳抗體質(zhì)量濃度確定

保持其余工作條件不變，采用1.2.1的流程分別對(duì)不同質(zhì)量濃度下的抗SEP單克隆抗體（1.64、3.28、6.56 μg/mL）、不同稀釋質(zhì)量濃度的抗 SEP兔血清（1.57、3.14、6.28 μg/mL）和不同稀釋度的IgG/HRP（稀釋度為 1:3000、1:6000）進(jìn)行檢測(cè)。陽(yáng)性孔用已知濃度的SEP蛋白純品作對(duì)照，陰性孔用PBS代替抗原，反應(yīng)結(jié)束，測(cè)定OD450nm值，并計(jì)算P/N值，根據(jù)P/N大小確定最佳抗SEP單克隆抗體和抗SEP兔血清濃度以及IgG/HRP最佳稀釋度。

1.2.3 最佳檢測(cè)條件確定

參照朱安妮[9]的方法，按照1.2.1的流程，在最佳抗體工作濃度的條件下，分別對(duì)不同種類(lèi)的緩沖液（0.1 mol/L，pH 9.2碳酸鹽）；1×PBS（pH 7.4）、封閉時(shí)長(zhǎng)（1、1.5、2 h）、抗原孵育時(shí)間（45、60、90 min）、羊抗兔IgG/HRP反應(yīng)時(shí)間（37 ℃：30、45、60 min）、TMB底物顯色時(shí)間（10、15、20 min）進(jìn)行 ELISA實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)陽(yáng)性孔和陰性孔的OD450nm，計(jì)算并選擇最大P/N值為最佳條件。

1.2.4 制備DAS-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照ELISA的工作程序，用夾心ELISA法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度SEP抗原（0.63、1.25、2.5、5、10、20 μg/mL），測(cè)定OD450nm值，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 靈敏度實(shí)驗(yàn)

利用DAS-ELISA法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的SEP蛋白（0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4 μg/mL），測(cè)試 SEP檢測(cè)方法的靈敏度。判斷標(biāo)準(zhǔn)：P/N＞2.0為陽(yáng)性。

1.2.6 精密度實(shí)驗(yàn)[9,13]

參考文獻(xiàn)方法，批內(nèi)變異將陽(yáng)性對(duì)照組（20、10、5 μg/mL），陰性對(duì)照組分別作 5個(gè)孔，同時(shí)檢測(cè)其OD450nm值；批間變異將上述標(biāo)本連續(xù)5次檢測(cè)OD450nm值。變異系數(shù)的計(jì)算公式為CV=(SD/ˉx)×100%

1.2.7 DAS-ELISA方法的特異性分析

取實(shí)驗(yàn)室保存的 SEK、SEI和 SEM 純品（10 μg/mL）作為樣品檢測(cè)。判斷標(biāo)準(zhǔn)：P/N＞2.0為陽(yáng)性結(jié)果。

1.2.8 測(cè)定人工污染樣品中SEP回收率

SEP人工污染基質(zhì)采用LB肉湯、牛肉糜和熟米飯。通過(guò)添加，使基質(zhì)中SEP的含量分別為2.5、5、10和20 μg/mL。利用所建立的SEP的DAS-ELISA方法，分別測(cè)定樣品和陰性對(duì)照的OD450nm，計(jì)算樣品的回收率。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)檢測(cè)樣品做三次重復(fù)，數(shù)據(jù)采用 excel軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳抗體質(zhì)量濃度的確定

采用方陣滴定法來(lái)確定單克隆抗體和抗血清配對(duì)的最佳工作濃度，結(jié)果如表1所示。

當(dāng)單克隆抗體的包被質(zhì)量濃度為3.28 μg/mL，抗SEP兔血清的質(zhì)量濃度為3.14 μg/mL的時(shí)候，P/N值最大，達(dá)到9.44。

因此確定抗體的最佳配對(duì)濃度為單克隆抗體3.28μg/mL，抗血清3.14 mg/L。

表1 不同抗體濃度配對(duì)下的OD450 nm值Table 1 The OD450 nm values under different antibody concentrations

2.2 最佳IgG/HRP稀釋度的優(yōu)化

表2 不同羊抗兔IgG/HRP稀釋度下的OD450 nm值Table 2 The OD450 nm values of different goat anti-rabbit IgG /HRP dilutions

注：加粗字體為酶標(biāo)抗體的最佳稀釋度。在最佳配對(duì)抗體濃度的條件下（即單克隆抗體質(zhì)量濃度為 3.28μg/mL，抗SEP兔血清質(zhì)量濃度為3.14 μg/mL），測(cè)定酶標(biāo)抗體稀釋度的OD450nm值。如表2所示，當(dāng)酶標(biāo)抗體的稀釋度為1:3000 時(shí)，P/N 值是9.68，因此，確定1:3000 為最佳IgG/HRP 稀釋度。

2.3 DAS-ELISA實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

根據(jù)2.1和2.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，單克隆抗體的包被濃度為3.28 μg/mL，抗SEP兔血清的濃度為3.14 μg/mL，羊抗兔IgG/HRP的稀釋度為1:3000，在此體系下對(duì)包被緩沖液、封板時(shí)長(zhǎng)、抗原孵育時(shí)間、酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間和TMB顯色時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，表3為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)P/N值最大的標(biāo)準(zhǔn)選擇最優(yōu)條件。因此，最終選擇包被緩沖液為1×PBS（pH 7.4），封閉時(shí)間為1 h，抗原孵育時(shí)間為90 min，酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間為30 min，TMB顯色時(shí)間為15 min。

表3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化Table 3 Optimization of experimental conditions

注：加粗字體為最佳實(shí)驗(yàn)條件。

2.4 新型腸毒素SEP的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 SEP雙抗夾心酶聯(lián)免疫法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of SEP double-antibody sandwich enzyme-linked immunoassay

根據(jù)2.1，2.2和2.3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在最優(yōu)條件下，選取不同濃度的SEP純品蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程是y=0.0313x+0.0262，R2=0.9946。SEP的DAS-ELISA方法適用檢測(cè)范圍是0.625～20 μg/mL。

2.5 建立方法的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用所建立的實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定不同質(zhì)量濃度的SEP蛋白純品，測(cè)定OD450nm，并計(jì)算P/N值。結(jié)果如表4所示。當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?.8 μg/mL時(shí)，P/N值為2.03，根據(jù) P/N值大于 2的標(biāo)準(zhǔn)，本研究建立的DAS-ELISA方法的實(shí)際檢測(cè)靈敏度為1.8 μg/mL。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

SEP的DAS-ELISA檢測(cè)方法的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示，由表5可以看出，批內(nèi)變異系數(shù)均小于6%，批間變異系數(shù)均小于15%，說(shuō)明此方法具有較好的重復(fù)性。

表4 檢測(cè)SEP的靈敏度實(shí)驗(yàn)Table 4 The sensitivity of SEP detection

表5 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Precision experiment results

2.7 DAS-ELISA方法的特異性結(jié)果

利用所建立的DAS-ELISA方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的金黃色葡萄球菌腸毒素K、I和M純品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表6所示，P/N＜2.0，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明該方法與金黃色葡萄球菌其他腸毒素蛋白之間不交叉。

表6 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Specific experimental results

2.8 人工污染樣品中SEP的回收率試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)將牛肉糜、熟米飯、LB肉湯中添加適當(dāng)濃度的SEP純品蛋白，采用建立的檢測(cè)方法檢測(cè)樣品中SEP的回收率。從表7可以看出，牛肉糜、熟米飯、LB肉湯樣品中SEP蛋白都具有較好的回收率，接近90%及以上。并且三種污染樣品中SEP的回收率隨著添加濃度的增加而增高，雖然存在樣品本身的差異性，但也能很好說(shuō)明建立的方法具有較高準(zhǔn)確度。

表7 人工污染樣品的回收率Table 7 Recovery of artificial contaminated samples

3 討論

ELISA方法具有靈敏度高，特異性好，檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有了廣泛應(yīng)用[14]。目前文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測(cè)也采用了該方法，如Morissette等[15]建立檢測(cè)奶酪中腸毒素SEB的夾心ELISA方法，市場(chǎng)上也有相應(yīng)試劑盒銷(xiāo)售，經(jīng)過(guò)改良后其靈敏度可達(dá)到 0.5 ng/mL。又如Rahimi等[16]檢測(cè)生牛乳中金黃色葡萄球菌腸毒素A的時(shí)候采用了ELISA試劑盒，靈敏度達(dá)到了0.2 ng/mL。但是，這些方法的建立和試劑盒的應(yīng)用大部分集中在對(duì)傳統(tǒng)金黃色葡萄球菌腸毒素 A-D的檢測(cè)上。而針對(duì)新型腸毒素檢測(cè)方法的研究相對(duì)比較少。

隨著研究的不斷發(fā)展，開(kāi)發(fā)針對(duì)新型腸毒素蛋白的檢測(cè)手段具有必要性。近年來(lái)，Nagaraj等[8]、朱安妮等[9]和Zhao等[10]分別建立了檢測(cè)腸毒素SEG、SEI和SEM的夾心ELISA方法。這些方法不斷豐富了調(diào)查金黃色葡萄球菌腸毒素污染食品的檢測(cè)手段。

本研究也建立了一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素SEP的DAS-ELISA方法，該方法在0.625～20 μg/mL范圍內(nèi)都具有較好的線性關(guān)系，建立方法的靈敏度為1.8 μg/mL，通過(guò)批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)以及人工加標(biāo)的回收率實(shí)驗(yàn)，證實(shí)建立的方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可用于金黃色葡萄球菌腸毒素P的定量檢測(cè)，也將具有良好的應(yīng)用前景。

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)單抗和多抗的濃度并不是添加量越高效果就越好，抗體濃度過(guò)高，會(huì)增加體系中的非特異性反應(yīng)，同時(shí)也會(huì)影響單抗的抗原表位，降低抗原抗體復(fù)合物的形成，使OD450nm降低。但如果抗體濃度過(guò)低，又會(huì)使抗原的結(jié)合位點(diǎn)減少，造成測(cè)量值比實(shí)際值低。本研究中使用的單克隆抗體的包被濃度為3.28 μg/mL，抗SEP兔血清的濃度為3.14 μg/mL。同時(shí)，封閉時(shí)間、抗原孵育時(shí)間、二抗反應(yīng)時(shí)間和TMB底物顯色時(shí)間也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，一般來(lái)說(shuō)TMB顯色時(shí)間越長(zhǎng)，顏色越深，OD450nm值越高。但如果延長(zhǎng)顯色時(shí)間也會(huì)使陰性孔的值升高，使P/N值反而降低，這與朱安妮等[9]的發(fā)現(xiàn)相似，本研究?jī)?yōu)化的顯色時(shí)間為15 min。另外，食品基質(zhì)的復(fù)雜性也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對(duì)于牛肉糜和熟米飯這兩種基質(zhì)來(lái)說(shuō)，SEP的濃度越高，回收率越好，而LB肉湯的回收率在不同SEP的濃度下都較好。以后可進(jìn)一步探索樣品的前處理手段和方法，以進(jìn)一步降低待測(cè)基質(zhì)本身對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響。還有在特異性實(shí)驗(yàn)中，我們把實(shí)驗(yàn)室保存的金黃色葡萄球菌腸毒素K、I和M蛋白進(jìn)行對(duì)照檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)腸毒素K、I和M與腸毒素P之間不存在交叉反應(yīng)，這是一個(gè)很好的結(jié)果。但本研究也還存在一定的缺陷，建立的方法的檢測(cè)限不夠靈敏，在今后的研究中我們將進(jìn)一步優(yōu)化條件，并且將建立更加豐富的樣品評(píng)價(jià)方案。

綜上所述，本研究初步建立了一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素SEP的DAS-ELISA方法，該方法可用來(lái)檢測(cè)被金黃色葡萄球菌污染食品中的SEP含量，將具有一定的應(yīng)用前景和借鑒意義。

4 結(jié)論

本研究建立了一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素P的雙抗夾心ELISA方法；該方法的回歸方程為y=0.0313x+0.0262，R2=0.9946；該方法檢測(cè)SEP毒素的靈敏度為1.8 μg/mL，精密度批內(nèi)變異低于6%，批間變異低于15%，對(duì)LB肉湯、牛肉糜和熟米飯回收率可達(dá)90%以上。

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