蓼子樸花精油體內(nèi)體外的抗菌活性

牛東玲，劉向才，李艷

（1.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏銀川 750021）（2.賀蘭山國家級自然保護區(qū)管理局，寧夏銀川 750200）

蓼子樸系菊科旋覆花屬多年生亞灌木植物，又名沙旋覆花。其營養(yǎng)繁殖能力極強，能很好地適應(yīng)惡劣的流沙環(huán)境，是一種優(yōu)良的固沙植物[1]，主要分布于我國西北部的寧夏、甘肅、青海、陜西和新疆等省區(qū)以及河北、山西北部和遼寧以西等地區(qū)，花及全草都可入藥，被用于治療外感發(fā)熱、小便不利、癰瘡腫毒和濕疹等[2]。蓼子樸在寧夏地區(qū)的野生資源儲量非常豐富，被當?shù)刈鳛橐环N草藥廣泛使用。目前國內(nèi)外學(xué)者對蓼子樸的化學(xué)成分已開展了深入的研究，報道了近五十種化合物，類型涉及黃酮類、甾醇類及倍半萜類等結(jié)構(gòu)類型的化合物[3～7]。近幾年生物活性研究發(fā)現(xiàn)，蓼子樸含有的倍半萜內(nèi)酯類化合物具有細胞毒方面的活性作用[4,6]。另有一些研究報道了蓼子樸的提取物對小菜蛾幼蟲、粘蟲和大皺鰓金龜?shù)染哂芯苁澈投練⒌男Ч鸞8～10]，并發(fā)現(xiàn)其提取物具有較強的抑菌活性，對小麥赤霉、蘋果炭疽、辣椒疫霉、玉米大斑等多種植物病原菌有 100%的抑制率[11]，但具體是什么成分在發(fā)揮作用未作研究。

植物精油（Plant Essential Oil）是一種從植物不同組織如果實、葉片、花和根中提取的揮發(fā)性液體，具有強烈的氣味和香味，按其化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同分為脂肪族、芳香族和萜類以及它們的含氧衍生物，此外還有含氮和含硫的化合物。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，植物精油及其單組份具有很強的抑制或殺死細菌和真菌等微生物的特性，加之植物精油具有低毒和環(huán)境友好等特點，將其開發(fā)作為一種水果采后病害的天然殺菌劑，前景廣闊[12～14]。

本研究本著充分開發(fā)利用寧夏沙生植物資源的目的，選取在寧夏地區(qū)廣泛分布的野生沙生植物蓼子樸作為研究對象，采用現(xiàn)代的提取分離技術(shù)超臨界流體萃取法從蓼子樸花中獲取植物精油，通過體內(nèi)體外抗菌活性實驗研究蓼子樸花精油的抗菌活性，并對精油抗菌成分進行了分析，以期為當?shù)刂参锞皖愃ｕr劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象

供試材料蓼子樸花在盛花期采集于寧夏中寧縣境內(nèi)，自然條件下陰干，粉碎過40目，貯于4 ℃冰箱備用。憑證標本保存在寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院標本室（NXAC）。新鮮的葡萄（紅提）果實于成熟期采摘于銀川郊區(qū)果園，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩嶒灂r選擇外觀圓潤、無受傷、無病害、健康的果實。

供試菌種蘋果炭疽菌（Glomerella cingulataSchr），番茄灰霉菌（Botrytis cirereaPers ex Tris），馬鈴薯干腐菌（Fusarium solani(Mart.) Sacc.）由西北農(nóng)林科技大學(xué)提供。采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。

1.1.2 儀器設(shè)備

普通光學(xué)顯微鏡，上海炳宇光學(xué)儀器有限公司；HP6890GC/5973氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海一恒科學(xué)技術(shù)有限公司；超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；CO2超臨界流體萃取設(shè)備，海安華安超臨界設(shè)備有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；全自動新型真空培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蓼子樸精油的提取

精確稱取115 g蓼子樸花樣品，利用CO2超臨界流體萃取裝置提取1.5 h，萃取壓力20 MPa，萃取溫度38 ℃，得到的精油，密封，4 ℃冰箱保存。

1.2.2 蓼子樸精油體外抑菌活性實驗

1.2.2.1 菌種純化

用配置好的PDA培養(yǎng)基（9個）進行接種，將3個菌種于超凈工作臺中接種（Z字劃線接種）到PDA培養(yǎng)基中，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后結(jié)合菌落形態(tài)特征，綜合分析是否供試菌是純培養(yǎng)。

1.2.2.2 孢子懸液的制備

確定為純培養(yǎng)后，在超凈工作臺中挑取適量菌，在斜面培養(yǎng)基上劃線，每種菌平行做3次，做好標記，置于培養(yǎng)箱中，在28 ℃培養(yǎng)7 d后，在每個試管培養(yǎng)基中加入5 mL 0.85%的生理鹽水，輕輕晃動，使孢子懸浮，形成孢子懸浮液，用血球計數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下觀察計算菌懸液中孢子的數(shù)目，用0.85%無菌生理鹽水控制菌懸液中孢子濃度在106個CFU/mL，待用。

1.2.2.3 蓼子樸精油溶液的配制

精確稱取蓼子樸精油100 mg，加適量的丙酮溶液稀釋（待精油完全溶解），用無菌水將精油溶液定容到100 mL，逐級倍比稀釋。

1.2.2.4 濾紙片瓊脂擴散法測定蓼子樸精油抑菌活性

采用濾紙片瓊脂平板擴散法[15]對蓼子樸精油抑菌效力進行測定。將經(jīng)斜面培養(yǎng)基上活化后的供試菌株，經(jīng)血細胞計數(shù)板法計數(shù)，配制成 1×106CFU/mL的菌懸液。在無菌環(huán)境下操作，使用滅過菌的移液槍吸取三種菌懸液各 100 μL分別均勻涂布于培養(yǎng)基平板上，備用。用打孔器將濾紙制成直徑為6 mm的小圓紙片，170 ℃干熱滅菌2 h后，將濾紙片浸潤配制好的蓼子樸精油稀釋液，將滅過菌的濾紙片浸潤等體積的丙酮溶液做為陰性對照。在無菌條件下將其貼在已涂布各種菌液的培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)條件27 ℃，48 h。每種菌設(shè)3個平行組，重復(fù)實驗3次。培養(yǎng)結(jié)束后，以十字交叉法測定抑菌圈直徑大小，求其平均值。

1.2.2.5 蓼子樸精油最小抑菌濃度（MIC）的測定

采用二倍稀釋法[16]，將精油液用丙酮溶液進行倍比稀釋，在 PDA培養(yǎng)基中添加經(jīng)丙酮稀釋過的不同濃度（12.5 mg/mL、6.25 mg/mL、3.13 mg/mL、1.56 mg/mL、0.78 mg/mL）的蓼子樸精油作為實驗組，空白對照培養(yǎng)基中添加丙酮作為對照，每組實驗重復(fù)三次。將3種供試菌種在斜面培養(yǎng)基上活化后，將供試菌種菌配成1×106CFU/mL的菌懸液，振蕩均勻，在每個實驗組中用無菌移液槍接種菌懸液0.1 mL，培養(yǎng)條件為27 ℃，培養(yǎng)48 h，若培養(yǎng)平板中出現(xiàn)菌落圈，則確定為微生物生長，若培養(yǎng)平板上完全無菌體生長，將無菌生長的樣品最低濃度確定為最小抑制濃度MIC。每個濃度及對照均設(shè)三個重復(fù)。

1.2.3 蓼子樸精油體內(nèi)抑菌活性實驗

1.2.3.1 浸泡法

將一定量的蓼子樸精油加入到 1%吐溫-20中（4:1），充分乳化，再用無菌水稀釋成3.13、6.25、12.5 mg/mL的稀釋液，對照用蒸餾水。

將隨機挑選的果實（20個）用各濃度稀釋液浸泡1 min。撈出晾干，將水果置于PE保鮮袋中，密封，于培養(yǎng)室內(nèi)進行貯藏，貯藏溫度為25 ℃，貯藏時間為12 d。每個處理分三個重復(fù)，每組隨機挑選20個果實。貯藏結(jié)束后，統(tǒng)計腐爛等級，并計算其腐爛指數(shù)[17]。腐爛指數(shù)(%)=∑(腐爛等級×該等級果數(shù))/(最高腐爛等級×調(diào)查總果數(shù))×100

1.2.3.2 熏蒸法

取隨機挑選的果實20個為一組，分別裝入含精油原油0.5 mL、1 mL和1.5 mL的小瓶，瓶口向上放在保鮮袋中。對照為不加精油，袋口密封。于培養(yǎng)室內(nèi)進行貯藏，貯藏溫度為25 ℃，貯藏時間為12 d。每處理三個重復(fù)。貯藏結(jié)束后，統(tǒng)計腐爛等級，并計算其腐爛指數(shù)。

1.2.4 蓼子樸精油成分分析

氣相色譜條件：Agilent HP-5毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為高純氦（99.999%），進樣量為1 μL，流速為1 mL/min，分流比為30:1。程序升溫為在60 ℃保持3 min，以1 ℃/min升溫到80 ℃，再以3 ℃/min速率升溫到280 ℃，保持20 min。

質(zhì)譜條件：離子源為EI，電離電壓為70 eV，離子源溫度為230 ℃，MS四極桿溫度為150 ℃，接口溫度為250 ℃，溶劑延遲3.0 min，掃描范圍為35～500 u。標準譜庫Wiley NIST 05進行檢索，峰面積歸一法計算各組分的相對百分含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

利用Microsofe Excel 2013處理數(shù)據(jù)，利用SPSS對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析，顯著水平為p＜0.01。

2 結(jié)果與討論

2.1 蓼子樸精油的體外抑菌活性

2.1.1 蓼子樸精油的體外抑菌效果

采用抑菌圈大小評價三種受試菌對蓼子樸花精油的抗菌敏感性，當精油濃度在100 mg/mL時，對三種果實采后病原菌（蘋果炭疽菌、番茄灰霉菌、馬鈴薯干腐菌）的抑制效果如表1所示。依據(jù)抑菌圈實驗判斷標準[18]：直徑＞20.00 mm為極高敏，＞15.00 mm為高敏，＞10.00 mm為中敏，＞6.00 mm為低敏，等于6.00 mm為不敏感。顯然，蓼子樸精油對三種受試菌的抑菌圈直徑均大于20 mm，屬于極高敏。李玉平等人[11]曾研究了蓼子樸全草的丙酮提取物對三種受試菌具有60%的抑制率，我們的實驗結(jié)果和他們的一致。

表1 受試菌對蓼子樸精油的抗菌敏感性Table 1 Antifungal susceptibility of the tested microorganisms to essential oils of Inula salsoloides flowers

2.1.2 蓼子樸精油的最小抑菌濃度

蓼子樸精油對三種受試菌的MIC見表2。當培養(yǎng)基中蓼子樸精油濃度為3.13 mg/mL時，三種受試菌（蘋果炭疽菌、番茄灰霉菌、馬鈴薯干腐菌）的生長均受到完全地抑制，平板上沒有菌落生長。因此，三種受試菌的MIC均為3.13 mg/mL。

表2 蓼子樸精油對三種受試菌的最低抑菌濃度Table 2 Mininal inhibitory concentration (MIC) of the essential oil of Inula salsoloides flowers for the three tested microorganisms

2.2 蓼子樸精油的體內(nèi)抑菌活性

2.2.1 蓼子樸精油浸泡處理后對葡萄采后自然腐爛的抑制效果

不同濃度的蓼子樸精油浸泡處理結(jié)果如表 3。采用精油浸泡處理的果實，腐爛等級相對較低。采用12.5 mg/mL蓼子樸精油浸泡處理的葡萄，腐爛指數(shù)為43.8%，與對照差異顯著（p＜0.01）。其它濃度處理后的水果腐爛指數(shù)和對照相比有所降低，但差異不顯著。顯然，浸泡法對于水果采后的防腐保鮮具有一定的作用，但由于精油溶液是由吐溫和水配置而成，浸泡后，在晾干的過程中，在水果表面不可避免地殘留有一定的水溶液，因而容易導(dǎo)致腐爛。

表3 蓼子樸花精油浸泡處理對葡萄自然腐爛的抑制效果Table 3 The rot rate of grape during storage after soaking treatment of essential oil solution from Inula salsoloides flowers

2.2.2 蓼子樸精油熏蒸處理后對葡萄自然腐爛的抑制效果

以熏蒸法處理結(jié)果如表 4。采用不同劑量的蓼子樸精油熏蒸處理后，對葡萄保鮮效果明顯，顯著地降低了水果的腐爛率。在精油量為0.5 mL時，葡萄僅有一級腐爛，腐爛指數(shù)為1.3%。隨著精油用量的增加，葡萄在整個貯藏期間保存完好，沒有任何腐爛現(xiàn)象的發(fā)生。貯藏結(jié)束后，采用熏蒸處理的葡萄，外觀沒有明顯可見的損害，沒有異味，色澤鮮亮。而對照的表面出現(xiàn)了達1/4面積的腐爛及褐色疤痕，腐爛指數(shù)達到了15%，葡萄顏色暗淡呈現(xiàn)褐色。顯然，熏蒸處理方式對葡萄的防腐保鮮效果顯著。

表4 蓼子樸精油熏蒸處理對葡萄自然腐爛的抑制效果Table 4 The rot rate of grape during storage after fumigation of essential oil from Inula salsoloides flowers

2.3 蓼子樸花精油抗菌成分分析

采用CO2超臨界流體萃取技術(shù)從蓼子樸花中得到的萃取物為淡黃棕色的油狀物，得率在12.28%，m/m。從總萃取物中共鑒定了49種成分，主要包括小分子的有機酸和它的酯，小分子的芳香族化合物，單萜，倍半萜，二萜及烷基烴。有21種成分屬于精油組分，占總萃取物的83.66%，其中香草醛占有最高的比例，達到 30.35%（表 5）。香草醛是一種具有顯著抗菌活性的化合物[19]，分析認為蓼子樸花精油在體內(nèi)體外所呈現(xiàn)出的抗菌活性與高含量的香草酚有直接的關(guān)系。與此同時，其它一些化合物也發(fā)揮了一定的協(xié)同作用，比如麝香草酚(3.51%)，該成分已被報道可以有效控制櫻桃的腐爛，并且被美國環(huán)境保護局(EPA)認為是對人體安全的防腐劑[20]。

趙堂[21]曾采用水蒸氣蒸餾法提取蓼子樸全草的精油，得到了20種成分，主要有2-壬酮(13.92%)、二乙醇縮乙醛(10.38%)、二乙二醇縮乙二醛(10.0%)、鄰丙?；郊姿峒柞?10.08%)、肉豆蔻酸(8.03%)和鄰苯二甲酸二乙酯(7.38%)等，他的分析結(jié)果和我們的測定結(jié)果差異較大。分析認為有兩種可能性，其一，不同的提取手段獲得的成分存在差異；其二，蓼子樸的不同部位所含的精油成分有差異，他研究的對象是蓼子樸的全草，我們主要提取的是蓼子樸的花。具體的原因，還有待進一步的研究。

表5 蓼子樸花精油的化學(xué)成分Table 5 Chemical constituents of essential oil from Inula salsoloides flowers

7 8.38 1-甲基-3,3-二甲基-環(huán)丙烯 C6H10 3.26 8 9.10 甲基-4-己酸甲酯 C8H16O2 3.08 9 11.67 苯乙酸乙酯 C10H12O2 3.48 10 13.23 苯乙酸 C8H8O2 1.35 11 14.07 麝香草酚 C10H14O 3.51 12 17.37 2-甲氧基-4-乙烯基苯酚 C9H10O2 1.57 13 19.82 香草醛 C8H8O3 30.35 14 21.64 肉桂酸乙酯 C11H12O2 1.36 15 22.25 二氫獼猴桃（醇酸）內(nèi)酯 C11H16O2 1.86 16 24.29 δ-杜松萜烯 C15H24 1.44 17 26.46 橙花叔醇 C15H26O 1.35 18 26.77 （-）-石竹烯氧化物 C15H24O 2.56 19 27.16 chloromethyl 9-chloroundecanoate C12H22Cl2O2 11.72 20 28.27 丁香醛 C9H10O4 1.33 21 30.43 5H-Inden-5-one,1,2,3,3a,4,7a-hexahydro-7a-methyl-,trans- C10H14O 1.87

3 結(jié)論

利用超臨界萃取法從蓼子樸花中提取出的精油，具有綠色安全無毒的特性，對果蔬采后病害的三種常見菌（蘋果炭疽菌、番茄灰霉菌、馬鈴薯干腐菌）均表現(xiàn)出較強的抑制活性。通過熏蒸方式處理當?shù)氐钠咸哑贩N紅提，防腐保鮮效果明顯，可有效延長果實的貯存期。這種處理方式不直接接觸水果，對水果的影響和損傷比較小，而且精油很容易揮發(fā)，不易在水果表面造成殘留，比較安全。通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析鑒定出蓼子樸花精油的主要成分為香草醛，該成分已是應(yīng)用很廣泛的日用香料和食品添加劑之一。因此，可以直接利用蓼子樸花精油或進一步通過分子蒸餾等手段來獲取香草醛等單體香料，為當?shù)厥称饭I(yè)開發(fā)出綠色安全的食品防腐劑或殺菌劑。

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