高效液相色譜測定食品中抗壞血酸含量的方法優(yōu)化

崔玲君，孫海新，李潔，趙美麗，周延培

（1.山東世通檢測評價技術(shù)服務(wù)有限公司，山東青島 266000）（2.青島即墨市段泊嵐動物衛(wèi)生與產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督站，山東即墨 266200）

L-抗壞血酸（又稱維生素C），是人體每日膳食推薦供應(yīng)量最大的一種維生素[1]，它能夠廣泛參與機體內(nèi)的各種氧化還原反應(yīng)，對人體新陳代謝及生命活動具有重要的影響。然而人體自身不能合成抗壞血酸，只能從食物中攝取[2]。因此準確測定食品中抗壞血酸的含量，對于評價食品的營養(yǎng)價值和食品質(zhì)量控制具有重要意義。目前常見的抗壞血酸測定方法有滴定法[3]、電化學法[4,5]、毛細管電泳法[6]、紫外光度法[7]、熒光法[3,8]、原子吸收光譜法[9]以及液相色譜法[10,11]等，以上方法均具有各自的優(yōu)越性，但是由于L-抗壞血酸極不穩(wěn)定，遇空氣中氧、熱、光、堿性物質(zhì)，特別是在有氧化酶及痕量銅等金屬離子存在時，易被氧化成為脫氫型抗壞血酸，因此保護L-抗壞血酸不被氧化是各檢測方法的技術(shù)關(guān)鍵。另外，L-抗壞血酸的光學異構(gòu)體-D-抗壞血酸，也常被用作食品添加劑，但其抗氧化活性只有L-抗壞血酸的5%[12]。因此，要準確測定食品中活性抗壞血酸的含量，即需要將不同構(gòu)型的抗壞血酸區(qū)分測定，以上研究大都沒有區(qū)分測定不同構(gòu)型的抗壞血酸，而是測定抗壞血酸的總量。目前，國內(nèi)外對液相色譜法測定不同構(gòu)型的抗壞血酸含量已經(jīng)開展了廣泛研究，其中克服提取物穩(wěn)定性差，抗壞血酸同分異構(gòu)體化學性質(zhì)相似，色譜分離不佳，前處理步驟繁瑣等問題[13]，成為標準化食品檢測機構(gòu)的行業(yè)技術(shù)瓶頸。針對上述問題，本文從樣品預(yù)處理、提取劑選擇、色譜條件等方面進行了探索優(yōu)化，建立了一種L-抗壞血酸、D-抗壞血酸和脫氫抗壞血酸同步測定方法，對于準確測定食品中活性抗壞血酸的組分含量、建立標準化操作規(guī)程具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器

G1260高效液相色譜儀，美國安捷倫；D-500均質(zhì)乳化機，德國維根斯；XW-80A漩渦混合器，上海滬西分析儀器廠有限公司；液氮，青島城陽長松氣體有限公司；研缽，北京金志業(yè)儀器設(shè)備有限公司；YCFS20-1000-S聚能式超聲波振動棒，杭州遠成超聲波科技有限公司；CF15RXII高速冷凍離心機，日本日立；CP225D電子天平，德國賽多利斯；MTN-5800氮吹儀，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；FE20+LE427 pH計，瑞士梅特勒-托利多。

1.2 試劑

L-抗壞血酸標準品、D-抗壞血酸標準品（≥99%，Sigma）；偏磷酸、硫代硫酸鈉、磷酸二氫鉀、草酸、磷酸、磷酸鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；癸胺（分析純，Sigma）；L-半胱氨酸（分析純，上海埃彼化學試劑有限公司）；實驗用水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。

1.3 實驗方法

1.3.1 HPLC色譜條件

Agilent(SB-C18，4.6×250 mm，5 μm)反相色譜柱；流動相為磷酸二氫鉀-癸胺混合溶液，濃度分別為0.025 mol/L、4.3 mmol/L，pH=2.7；檢測波長245 nm（抗壞血酸在244 nm～265 nm有最大吸收峰[14]）；流速0.7 mL/min；柱溫27 ℃；進樣量10 μL。

1.3.2 標準曲線的繪制

用偏磷酸-硫代硫酸鈉混合溶液（濃度分別為0.25 mol/L、0.019 mol/L），將混合標準品儲備液適當稀釋，配制成系列混合標準品工作液，在1.3.1節(jié)所述色譜條件下，采用外標法對系列標準溶液的峰面積（y）和相應(yīng)的質(zhì)量濃度（x）進行線性回歸計算，見表1。

表1 L-抗壞血酸和D-抗壞血酸的線性方程Table 1 Regression equations of L-ascorbic acid and D-ascorbic acid

1.3.3 樣品前處理

A液制備：稱取2～3 g樣品（精確至0.001 g）置于具塞離心管中，加入 0.25 mol/L偏磷酸和 0.019 mol/L硫代硫酸鈉混合提取液，渦旋溶解并定容至25 mL。搖勻，冰浴超聲3 s、間歇5 s，90～100個循環(huán)；0 ℃、9000 r/min離心5 min，吸取部分上清液，經(jīng)0.22 μm水相膜過濾后轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，用于測定L-抗壞血酸和D-抗壞血酸含量；

B液制備：取10 mL A液，離心后收集上清液于具塞離心管中，加入5 mL現(xiàn)配0.177 mol/L的L-半胱氨酸溶液，用磷酸三鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2，常溫振蕩5 min。

再用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5～2.8，用高純水定容至25 mL。搖勻，經(jīng)0.22 μm水相膜過濾后轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，用于測定L-抗壞血酸的總量。

1.4 結(jié)果計算與數(shù)據(jù)處理

按下式計算試樣中抗壞血酸的含量：

式中：X為試樣中抗壞血酸含量，(mg/100 g)；C為樣液中抗壞血酸的質(zhì)量濃度，(mg/L)；C0為樣品空白液中抗壞血酸的質(zhì)量濃度，(mg/L)；V為試樣的最后定容體積，(mL)；m為實際檢測試樣質(zhì)量，(g)；1000，100均為換算系數(shù)(由mg/L換算成mg/mL的換算因子)；F為稀釋倍數(shù)(發(fā)生還原步驟為2.5)。

L-抗壞血酸、D-抗壞血酸的含量直接由上式計算得出；脫氫抗壞血酸含量由B液中測得的L-抗壞血酸總量與A液中測得的L-抗壞血酸含量之差計算得到。

測定結(jié)果用兩次平行測定的算術(shù)平均值表示，保留3位有效數(shù)字。采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相的選擇

考察磷酸二氫鉀和癸胺的濃度對兩種抗壞血酸峰形和分離效果的影響，不同濃度組成時的HPLC圖見圖1。由圖中a、b和c可知，隨著癸胺濃度的提高，分離度有所提高，癸胺有增加D-抗壞血酸保留時間的作用[12]。當磷酸二氫鉀-癸胺緩沖鹽溶液濃度分別為0.05 mol/L、8.6×10-3mol/L時分離度最佳，但太高的緩沖鹽濃度會縮短色譜柱使用壽命，因此，將磷酸二氫鉀-癸胺濃度同時減半，即濃度分別為0.025 mol/L、4.3×10-3mol/L時，分離效果最好，峰形尖銳、對稱（見圖1d）。出峰順序依次為L-抗壞血酸、D-抗壞血酸，故選擇該濃度的緩沖鹽作流動相。

圖1 標準溶液在不同流動相配比時的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of standard solution at different mobile phase ratios

2.1.2 破碎處理方式對提取效果的影響

圖2 破碎處理方式對提取效果的影響Fig.2 Effect of crushing treatment on the extraction efficiency

針對果蔬樣品的前處理，對比了機械勻漿[15]和液氮冷凍研磨兩種破碎方法對提取效果的影響（見圖2）。機械勻漿：取100 g左右樣品，加入等質(zhì)量的提取液，經(jīng)均質(zhì)機均質(zhì)并混合均勻，然后取 4～6 g（精確至0.001 g）勻漿試樣，用于測試。液氮冷凍研磨：稱取2～3 g（精確至0.001 g）樣品置于研缽中，加入適量液氮，迅速研磨至細粉，然后加入提取液混勻，全部轉(zhuǎn)移至離心管中用于測試。由圖2可知，獼猴桃果實經(jīng)機械勻漿后L-抗壞血酸獲得量為87.30 mg/100 g，經(jīng)液氮冷凍研磨獲得量為94.20 mg/100 g，兩者相差6.90 mg/100 g，經(jīng)t檢驗，兩者在95%置信區(qū)間內(nèi)存在顯著性差異。二者比較，以液氮冷凍研磨提取效果更好。并且使用液氮研磨還有以下優(yōu)勢：樣品用量少，便于進行加標回收實驗。

2.1.3 提取劑的選擇

抗壞血酸具有較強的還原性，容易受到光照、溫度、金屬離子和貯存條件等的影響[16]，但在酸性條件下相對穩(wěn)定[17]，因此選取了 0.10 mol/L草酸、0.10 mol/L磷酸、0.25 mol/L偏磷酸作為提取劑，使用羊乳粉樣品，分別做三水平添加回收實驗，結(jié)果顯示用0.25 mol/L偏磷酸作為提取液回收率高，且不同添加水平之間的相對標準偏差小，見表2。因此實驗選取0.25 mol/L偏磷酸作為提取液。

按外標法計算，測得此乳粉中只含有L-抗壞血酸，含量為81.50 mg/100 g，不含D-抗壞血酸，該乳粉標簽顯示維生素C平均含量為87.29 mg/100 g，測定值為示值的93.4%。食品營養(yǎng)強化劑使用標準中規(guī)定，維生素C的使用量為30 mg/100 g～100 mg/100g[18]，此乳粉符合標準。

圖3 硫代硫酸鈉對提取物穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of Na2S2O3 on the stability of extractive

穩(wěn)定性實驗：對比偏磷酸提取液和含硫代硫酸鈉保護劑的偏磷酸提取液，提取的樣品穩(wěn)定性。分別在4 ℃下放置0 h、6 h、16 h、24 h，依次測定其抗壞血酸含量（見圖3），顯然，隨著放置時間的延長，偏磷酸提取的樣品抗壞血酸含量呈下降趨勢，24 h后減少40%，可見0.25 mol/L偏磷酸提取液提取的樣品性質(zhì)不穩(wěn)定。而當在偏磷酸提取液中加入0.019 mol/L硫代硫酸鈉時，樣品提取物可以在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定，相對標準偏差RSD＜2%，無顯著性差異（見圖3），且實驗過程無需避光，說明加入硫代硫酸鈉保護劑，可以克服批量檢驗周期長所導致抗壞血酸氧化的問題，這與李野[19]研究結(jié)果吻合。

2.1.4 氮吹除氧對抗壞血酸提取效果的影響

圖4 氮吹除氧對抗壞血提取效果的影響Fig.4 Effect of the treatment (with or without nitrogen) on the extraction of ascorbic acid

研究表明，在充足的氮氣條件下，可以有效避免抗壞血酸的損失[20]。上述 1.3.3步驟中，將提取得到的樣品溶液氮吹10 min，以排除試液和離心管中的氧氣，測定結(jié)果見圖 4，獼猴桃樣品溶液氮吹除氧得到抗壞血酸含量為 93.01 mg/100 g，不除氧測得 94.20 mg/100 g，兩者無顯著差異；且除氧操作使得結(jié)果相對標準偏差大，可能是在氮吹除氧過程中，氮吹管接觸試液導致樣品損失，引入操作誤差。綜上，只需將提取液預(yù)先氮吹除氧，樣品溶液無需再次除氧。

表2 提取液對回收率的影響（n=5）Table 2 Effect of extraction solution on the recoveries of ascorbic acid (n=5)

2.2 方法應(yīng)用-山楂飲料中抗壞血酸含量測定

稱取2～3 g樣品（精確至0.001 g）置于具塞離心管中，加入1 g C18填料用于吸附樣品中的雜質(zhì)，其他操作均按照1.3.3節(jié)進行，色譜圖見圖5，色譜峰峰型對稱，兩種抗壞血酸分離度高，有一個非目標化合物峰，無干擾。此飲料中同時含有 L-抗壞血酸、D-抗壞血酸，不含脫氫抗壞血酸。根據(jù)外標法計算，L-抗壞血酸、D-抗壞血酸含量分別為0.93 mg/100 g、1.64 mg/100 g。其中L-抗壞血酸既是營養(yǎng)物質(zhì)又是抗氧化劑，D-抗壞血酸有保色的作用，抗氧化作用不大。即該飲料中有生理活性的抗壞血酸含量不到40%。

圖5 山楂飲料的高效液相色譜圖Fig.5 HPLC of hawthorn beverages

3 結(jié)論

3.1 本文通過對流動相、破碎方法、提取劑的探索優(yōu)化，建立了一種同步測定食品中L-抗壞血酸、D-抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的方法。該方法可以區(qū)分測定不同構(gòu)型的抗壞血酸，前處理操作簡單高效、樣品性質(zhì)穩(wěn)定，適用于水果、蔬菜、果汁和乳粉等樣品中抗壞血酸含量的測定，應(yīng)用范圍廣泛。為食品檢測行業(yè)建立標準化操作規(guī)程、準確測定食品中各種抗壞血酸組分的含量及客觀評價食品的營養(yǎng)價值提供可靠了技術(shù)支持。

3.2 該方法需要將脫氫抗壞血酸還原成L-抗壞血酸，然后計算得到脫氫抗壞血酸的含量，今后研究的關(guān)鍵應(yīng)該是脫氫抗壞血酸不經(jīng)過還原而與L-抗壞血酸、D-抗壞血酸同步測定，這是具有挑戰(zhàn)性的。最佳的解決方案可能是使用通用型探測器通過檢測物理化學性質(zhì)而同步測定不同的抗壞血酸。比如，帶電氣溶膠檢測(CAD)可以分別測定不同物質(zhì)的性質(zhì)。另外，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用同步測定 L-抗壞血酸、D-抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的報道并不多見，這些工作需要在今后的技術(shù)方法開發(fā)中進一步探索。

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