GC-MS法建立血液、尿液中安定類藥物的定性、定量檢測方法及應(yīng)用

阿力亞·阿西木， 爾西丁·買買提， 孫力揚， 艾克拜爾·熱合曼

(新疆醫(yī)科大學(xué)1公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室, 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)教研室， 烏魯木齊 830011)

近幾年來，隨著現(xiàn)代社會發(fā)展速度的加快，生活壓力越來越大，抑郁、失眠、焦慮、神經(jīng)緊張的等亞健康狀態(tài)越來越常見。一項調(diào)查表明，國外成年人中50%～60%人的睡眠質(zhì)量很差，而我國睡眠障礙發(fā)生率也在40%左右并具有越來越年輕化的趨勢[1]。輕度的睡眠障礙可采用改善睡眠環(huán)境和作息時間，以及調(diào)整飲食習(xí)慣等心理和行為治療；嚴(yán)重的睡眠障礙可選用藥物治療，當(dāng)前臨床上安定類藥物以高效、安全、耐受性好等優(yōu)點普遍被首選用在針對失眠、焦慮等癥狀的治療[2]。

本研究常見的安定類藥物主要有阿普唑侖，溴安定，氯硝西泮，地西泮等14種。此類藥物在臨床上普遍用來催眠、鎮(zhèn)定、抗焦慮、抗驚厥以及抗精神失常[3-6]。不合理用藥可致呼吸麻痹死亡，正因如此，臨床不合理用藥，誤用或誤服導(dǎo)致的安定類藥物中毒的報道越來越常見，某些自殺或投毒搶劫案件也經(jīng)常涉及到安定類精神類藥品[7]。因此，建立精神類(安定類)藥物的快速、準(zhǔn)確地篩選和確證的檢測分析方法在臨床診斷和司法鑒定領(lǐng)域中非常必要[8]。

由于血液、尿液等生物檢材中藥物濃度隨著時間及代謝逐漸降低，難以檢出[9]。目前，安定類藥物的檢測方法主要有氣相色譜法(Gas Chromatography，GC)、高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(Liquid Chromatography-Mass spectrograph，LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(Gas Chromatography-Mass spectrograph，GC-MS)等[10-11]，本研究嘗試應(yīng)用被普遍認(rèn)為法醫(yī)鑒定中的金標(biāo)準(zhǔn)GC/MS法對血液、尿液中安定類藥物進(jìn)行定性定量分析[12]。

1 材料與方法

1.1儀器與試藥

1.1.1 儀器氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(氣相色譜為Agilent 7890B，質(zhì)譜為Agilent 5977A)，TDL-508型離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)，HGC-12A型靜音無油空壓機(天津恒高科技有限責(zé)任公司)，XH-J型振蕩器(金壇市醫(yī)療儀器廠)，AB135-S型電子分析天平(瑞典，METTLER TOLEDD)，氣質(zhì)聯(lián)用儀色譜柱子(HP-5MS，Agilent)，固相萃取微型小柱(SPE，BOND ELUT-CERTIFY,VARIAN公司)。

1.1.2 試藥 安定類藥物標(biāo)準(zhǔn)品：阿普唑侖(批號A903)、氯氮卓(批號C022)、氯硝西泮(批號C907)、地西泮(批號D907)、咪達(dá)唑侖(批號M908)、硝西泮(批號N906)、奧沙西泮(批號O902)、普拉西泮(批號P906)、替馬西泮(批號T907)、三唑侖(批號T910)、去甲地西泮(批號N905)、溴安定(批號B903)、勞拉西泮(批號L901)、氟硝西泮(批號F907)等標(biāo)準(zhǔn)樣品(液體)通過烏魯木齊市公安局刑科所購買于Sigma公司，濃度均為1 mg/mL；SKF-525 a(純度97%，粉末狀，用于內(nèi)標(biāo)，批號P1061)，公安部物證鑒定中心提供；甲醇、乙酸乙酯、丙酮等均為色譜純試劑；鹽酸、氨水、二氯甲烷為分析純試劑；實驗室自配的0.1 mol/mL pH=6.0磷酸緩沖液和pH=9.18的硼砂緩沖液；Bond Elut Plexa固相萃取小柱(130 mg，3 mL)，購自Varian公司。

1.2標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配置 阿普唑侖、氯氮卓、氯硝西泮、地西泮、咪達(dá)唑侖、硝西泮、奧沙西泮、普拉西泮、替馬西泮、三唑侖、去甲地西泮、溴安定、勞拉西泮、氟硝西泮等標(biāo)準(zhǔn)品濃度均為1.0 mg/mL。將各標(biāo)準(zhǔn)品分別放入已標(biāo)記編號的10 mL干凈容量瓶并加甲醇稀釋到刻度位置，即配置濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。從各儲備液中取100 μL分別放入的進(jìn)樣瓶中添加甲醇900 μL稀釋至1 mL，獲得濃度為10 μg/mL各標(biāo)準(zhǔn)品的儲備工作溶液。再次從各10 μg/mL儲備液稀釋得到濃度為1 μg/mL工作溶液，封口，放在4℃冰箱保存。

1.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配置 準(zhǔn)確稱取20 mg普羅地芬鹽酸鹽(SKF-525a)作為內(nèi)標(biāo)，放入10 mL容量瓶中并用甲醇溶解準(zhǔn)備濃度為2 mg/mL的內(nèi)標(biāo)母液。用移液槍移取20 μL母液放入進(jìn)樣瓶中加980 μL甲醇稀釋準(zhǔn)備1 mL 40 μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液，再度稀釋制備4 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，放置4℃冰箱保存。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制將無任何服用安定類藥物史的志愿者血液和尿液作為空白血液和尿液，用于制備標(biāo)準(zhǔn)系列溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。血液：針對每一種安定類藥物制備6個離心管，進(jìn)行編號。分別加入2 mL空白血液，每份樣品添加50 μL濃度為4 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液。已添加內(nèi)標(biāo)溶液的第一份血樣作為空白對照樣不添加標(biāo)準(zhǔn)品溶液，從第二份血樣開始每份樣品中加入適量的1 μg/mL的14種安定類藥物的標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制濃度為10、20、40、80、200 ng/mL的阿普唑侖、溴安定、咪達(dá)唑侖、去甲地西泮；濃度為2、5、20、50、100 ng/mL的氯硝西泮、普拉西泮；濃度為20、50、100、200、400 ng/mL的氯氮卓、地西泮、奧沙西泮、替馬西泮；濃度為1、2、10、20、40 ng/mL的氟硝西泮、三唑侖；濃度為5、10、20、50、100 ng/mL的硝西泮、勞拉西泮標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。尿液：同樣對每一種安定類藥物制備6個離心管，進(jìn)行編號。分別加入2 mL空白血液，每份樣品添加50 μL濃度為4 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液。已添加內(nèi)標(biāo)溶液的第一份尿樣作為空白對照樣不添加標(biāo)準(zhǔn)品溶液，從第二份血樣開始每份樣品中加入適量的1 μg/mL的14種安定類藥物的標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制濃度為10、20、40、80、200 ng/mL的阿普唑侖；濃度為20、50、100、150、300 ng/mL的溴安定、氯硝西泮；濃度為20、50、100、200、400 ng/mL的氯氮卓、地西泮、奧沙西泮、替馬西泮；濃度為5、10、20、50、100 ng/mL的氟硝西泮、勞拉西泮、硝西泮、普拉西泮；濃度為10、20、50、100、200 ng/mL的咪達(dá)唑侖；濃度為10、25、50、100、200 ng/mL的去甲地西泮、三唑侖標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3樣品的制備

1.3.1 血樣的前處理 準(zhǔn)確移取2 mL血樣置于15 mL離心試管中，添加約30 mg 碳酸銨，調(diào)節(jié)pH值約為8，滴加4 mL乙酸乙酯(與樣品比值2∶1，需要注意的是滴加過程中試管必須始終保持震蕩狀態(tài))，以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，將上層有機相轉(zhuǎn)移過濾至已經(jīng)標(biāo)簽好的10 mL試管中用氮吹儀吹干，最后加2 mL pH=9.5的緩沖溶液溶解。此溶液將進(jìn)一步過固相萃取柱子。

1.3.2 尿樣的前處理 準(zhǔn)確移取2 mL尿樣(待測樣或空白尿樣)置于15 mL離心試管中，標(biāo)準(zhǔn)品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的添加方式和量與血樣的前處理一致，各樣品中再加入2 mL β-葡萄糖苷酸酶，震蕩，搖勻；放在65℃水浴箱中水解3 h，再以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，將上層有機部分轉(zhuǎn)移并過濾至已經(jīng)標(biāo)簽好的安瓿瓶中待進(jìn)一步過固相萃取柱子。

1.3.3 固相萃取(SPE) (1)活化SPE柱子：首先用2 mL甲醇溶劑添加SPE柱子中，加2 mL純水(去離子水)淋洗活化柱子。(2)SPE柱子中填充樣品：將方法“1.3.1”和“1.3.2”項中前處理過的血樣或尿樣加入SPE柱子中，以1 mL/min流速過濾樣品溶液。(3)洗滌SPE柱子：先用2 mL去離子水淋洗，然后用2 mL甲醇：純水(20∶80)混合液洗滌，減壓抽干2 min。(4)萃取提?。禾砑? mL甲醇溶液加入抽干的柱子中并將目標(biāo)物洗脫于2 mL安瓿瓶中。(5)吹干提取液：將安瓿瓶中的2 mL洗脫液置于氮吹儀上吹干。(6)定容：添加50 μL乙酸乙酯定容。(7)準(zhǔn)備進(jìn)樣瓶：溶液移入內(nèi)有200 μL內(nèi)插管的2 mL進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜法分析。

1.4氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀條件氣相色譜條件為：色譜柱為Agilent HP-5MS,(30 m×0.250 mm×0.25 μm)，載氣：高純氦氣(He),流速1.0 mL/min；程序升溫模式：柱溫60℃(恒溫)，保持1 min，再以30℃/min速度升到235℃(程溫)，保持5 min；再以20℃/min速度升到290℃，進(jìn)樣口溫度：250℃；檢測器溫度：300℃。質(zhì)譜條件為：EI離子源，電子能量70ev，離子源溫度230℃。調(diào)諧方式為自動調(diào)諧，倍增電壓1 073 v，發(fā)射電流100 μA，掃描范圍50～500 m/z。

1.5方法學(xué)考察

1.5.1 線性關(guān)系的測定 按照“1.2.3”所采用的方法對空白尿樣和空白血樣中添加內(nèi)標(biāo)溶液和濃度呈梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用前處理方法對空白對照樣和系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行處理和GC-MS檢測信號強度(峰面積)。以待測物濃度為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，運用最小二乘法原則進(jìn)行回歸運算，求得直線回歸方程和線性范圍,見表1。

2 結(jié)果

2.114種安定類藥物的結(jié)構(gòu)式、保留時間和離子質(zhì)荷比(m/z) 氯氮卓、地西泮、勞拉西泮、去甲地西泮、奧沙西泮等安定類藥物若采用普通常溫溫度程序進(jìn)行分離，以上幾種成分色譜保留時間差距極微，即分離度較差，需按本文提出的色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，14種安定類藥物具有比較好的分離度。14種安定類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式、分子量和EI全掃描質(zhì)譜見圖1，14種安定類標(biāo)準(zhǔn)物的色譜圖見圖2。14種安定類藥物的保留時間和特征性離子質(zhì)核比見表2。

表1 血樣和尿樣的回歸方程及線性范圍

表2 14種安定類藥物的特征離子質(zhì)核比、保留時間、最低定量限(LOQ)以及最低檢出限(LOD)

2.2平均回收率、準(zhǔn)確度和精密度的測定按照樣品前處理方法操作處理后用GC-MS檢測出來的檢測量、峰面積比值與加入量比較，重復(fù)以上實驗步驟3次，測定檢出量計算其回收率、SD、RSD等相關(guān)指標(biāo)。血液中各安定類藥物的平均回收率、SD、RSD范圍分別是在96.63～103.06、0.04～6.92、0.33%～8.16%。尿液：按照樣品前處理方法操作處理后用GC-MS檢測出來的檢測量、峰面積比值與加入量比較，重復(fù)以上實驗步驟3次，測定平均檢出量計算其平均回收率、RE、RSD等相關(guān)指標(biāo)。尿液中14種安定類藥物平均回收率、準(zhǔn)確度、精密度范圍是在93.75～100.79、0.04～3.56、0.28%～10.13%，見表3。

2.3案件樣品的含量測定2017年5月，烏魯木齊市某區(qū)公安局發(fā)現(xiàn)一具不明原因死者尸體，死者李某，男，懷疑為吸毒死亡。經(jīng)過對公安局送來的死者尿樣利用已建立好的前處理方法(在堿性條件下水解后固相萃取SPE法提取)，分離、提取后，采用GC-MS儀SIM模式進(jìn)行檢測，尿液檢出含量為0.34 μg/mL的地西泮與含量為1.5 μg/mL的代謝物去甲地西泮。檢測結(jié)果表明，本方法適合于安定類藥物及代謝物在各類案件中的定性定量要求。圖3為案件尿液中檢出的地西泮和去甲地西泮的SIM模式總離子流圖。

表3 血液和尿液中14種安定類藥物的回收率、R.E以及RSD

1:硝西泮；2:奧沙西泮；3:勞拉西泮；4:地西泮；5:氯氮卓；6:去甲地西泮；7:咪達(dá)唑侖；8:氟硝西泮；9:普拉西泮；10:氯硝西泮；11:溴安定；12:替馬西泮；13:三唑侖；14:阿普唑侖

圖214種安定類標(biāo)準(zhǔn)物的色譜圖

3 討論

3.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化安定類藥物是屬于極性分子，而且分子量較大，因此以極性較弱的HP-5MS型毛細(xì)管柱子作為GC-MS儀柱子，采用全掃描(Full Scan)模式和選擇離子(SIM)模式進(jìn)行測試，將14種待測物的保留時間和特征離子質(zhì)譜圖進(jìn)行對比定性分析。選擇離子模式檢測靈敏度更高，可做定量分析，對每一種標(biāo)準(zhǔn)品選擇了4個特征離子(m/z)，根據(jù)同一個保留時間內(nèi)出現(xiàn)的4個特征離子峰重疊性來定性標(biāo)準(zhǔn)品，為此不但可以降低混合物質(zhì)的影響，而且在相同的掃描速度下，既增多了掃描次數(shù)，也提高了準(zhǔn)確度、精密度以及靈敏度。

3.2SPE條件SPE法常用于比較難處理的血液、尿液等生物樣品所包含的堿性或者酸性毒品成分的萃取。為確保對安定類藥物14種類型均有效，并提高檢測靈敏度，本實驗的前處理使用Agilent Bond Elut Certify固相萃取小柱，結(jié)果較為滿意。因此按照標(biāo)準(zhǔn)濃度配好的目標(biāo)物運用混雜物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響較小的GC-MS法檢測并獲得了較好的實驗數(shù)據(jù)。

3.3工作曲線線性范圍的選擇和LOD與LOQ的制定本文中的工作曲線(回歸曲線)線性范圍是根據(jù)待測物濃度范圍、藥物中毒范圍、臨床上發(fā)揮藥理作用的血藥濃度范圍，再結(jié)合運用的儀器條件來確定[13]。安定類藥物最低檢出限和最低定量限范圍在血液和尿液中的存在一定的差異，在血液中的最低檢出限在1～20 ng/mL內(nèi)，最低定量限范圍則是在2～50 ng/mL內(nèi)；而安定類在尿液中的最低檢出限在2～10 ng/mL內(nèi)，最低定量限在10～50 ng/mL內(nèi)，均低于藥物的治療濃度，足以滿足法醫(yī)毒物學(xué)分析、公共衛(wèi)生突發(fā)事件和臨床毒物學(xué)檢測中毒或治療濃度的需要[14]。

本文建立了對14種常見安定類藥物進(jìn)行有效分離、提取并GC-MS定性定量分析方法。通過應(yīng)用在實際案件中驗證此方法，為后期濫用安定類人員的治療與司法鑒定工作提供有效實驗數(shù)據(jù)和輔助依據(jù)。

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