長鏈非編碼MALAT1在宮頸癌轉(zhuǎn)移中的作用

張 蕾, 胡爾西旦·尼牙孜， 趙化榮， 忙尼沙·阿不都拉， 迪麗達(dá)爾·斯地克， 王 靜，張 洋， 葉建蔚， 包永星

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心一科, 烏魯木齊 830054)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)腫瘤常見的腫瘤之一。我國每年宮頸癌新發(fā)病例占世界新發(fā)病例總數(shù)的1/5左右[1]。因此，預(yù)測宮頸癌新的標(biāo)志物，以及闡明宮頸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的分子水平機(jī)制，是提高宮頸癌患者生存率的首要問題，同時(shí)在治療前通過對腫瘤放射敏感性的檢測評估放療療效是及其重要的，為選擇合理而有效的治療提供有力的依據(jù)。因而與放療療效相關(guān)的分子標(biāo)志物研究廣受關(guān)注。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是最近幾年發(fā)現(xiàn)的一系列轉(zhuǎn)錄物，長鏈非編碼RNA的長度一般都超過200 nt，雖然它們不具有編碼蛋白質(zhì)的具體功能，但調(diào)節(jié)mRNA的 剪切、降解以及翻譯等過程發(fā)揮著其重要的作用[2]。lnc RNA 也逐漸被認(rèn)為是腫瘤的相關(guān)分子，可以作為惡性腫瘤新的標(biāo)志物來研究。肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1 (metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript1 MALAT1) 在人類非小細(xì)胞肺癌中被首次發(fā)現(xiàn)，也是最早被發(fā)現(xiàn)的lnc RNA 之一[3]?，F(xiàn)將研究結(jié)果深入的進(jìn)行下去，與近期的國際研究熱點(diǎn)結(jié)合，了解長鏈非編碼RNA與宮頸癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，著眼于提高宮頸癌綜合治療的療效，同時(shí)尋找新疆宮頸癌的預(yù)后預(yù)測指標(biāo)。本研究將miRNA- 143、MALAT1的慢病毒轉(zhuǎn)載至HeLa細(xì)胞株上，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)，細(xì)胞增殖試驗(yàn)(MTT)分析細(xì)胞的增殖，采用west blot來分析波形蛋白等方法，測定miRNA- 143和長鏈非編碼RNA MALAT1是否促進(jìn)細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移及侵襲，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料人類宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。Dulbecco的鏈霉素/青霉素，胎兒牛血清購買于美國沃爾瑟姆試劑公司。轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄RNA引物由中國Sangon生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)并合成。lipofectamine TM2000和Trizol試劑盒購買于中國Sangon有限公司。熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購買于中國Sangon生物技術(shù)公司。Trans-well試劑、反單克隆抗體、兔抗人e-cadherin多克隆抗體、抗小鼠二級(jí)抗體結(jié)合堿性磷酸酶、小鼠抗人類β-actin抗體購自美國圣克魯斯生物技術(shù)有限公司。

1.2分組方法HeLa細(xì)胞株被分為5組，即空白組、miRNA-143轉(zhuǎn)染組、MALAT1轉(zhuǎn)染組、miRNA-143抑制劑轉(zhuǎn)染組和MALAT1抑制劑轉(zhuǎn)染組。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1 HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)方法 將HeLa細(xì)胞在Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HeLa細(xì)胞。慢病毒載體轉(zhuǎn)染：miRNA-143、MALAT1、miRNA-143抑制劑和MALAT1抑制劑的載體由Sangon生物科技有限公司合成引物，見表1。從瓊脂糖凝膠中提取出線性化的載體片段含堿性磷酸酶，觀察至提取生長發(fā)育階段的細(xì)胞，植入96孔板中，分為miRNA-143轉(zhuǎn)染組、MALAT1轉(zhuǎn)染組、miRNA-143抑制劑轉(zhuǎn)染組、MALAT1抑制劑轉(zhuǎn)染組和對照組。逆轉(zhuǎn)錄定量PCR(RT- qPCR)：使用Trizol試劑盒進(jìn)行RNA提取，共使用了200個(gè)ng RNA作為合成cDNA的模板。采用cDNA作為模板和引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測定在生長發(fā)育階段的HeLa細(xì)胞數(shù)并接種在培養(yǎng)皿中生長。經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在含DMEM培養(yǎng)基中孵育2%胎牛血清24 h，然后在含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中孵育,細(xì)胞中加入20 μL 細(xì)胞增殖液(5mg/mL) 保留4 h,分別孵化10 min與15 min，測定570 nm處的吸光度值。

1.3.2 Trans-well試驗(yàn) 基底膜基質(zhì)添加trans-well室孵化24 h,然后在無血清培養(yǎng)基水化1 h。將Post-transfection細(xì)胞保留在反式培養(yǎng)基的上部培養(yǎng)1 h，下部灌注RPMI1640媒介，用Giemsa染色法進(jìn)行顯微觀察其變化。

1.3.3 Western blotting試驗(yàn) 將Hela細(xì)胞在指數(shù)期為8%膠片上分離40 μg溶解產(chǎn)物，將e-cadherin蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Thermo Fisher Scientific)，在5% BSA(細(xì)胞信號(hào)技術(shù))溶解1 h后，膜與原抗體(抗e-cadherin)孵育或波形蛋白結(jié)合,分別在1∶200和1∶500(β-actin)孵化30 min，用TBST(tris-緩沖生理鹽水和Tween 20，pH 7.5)加入至緩沖器中沖洗，最后用次級(jí)抗體(1∶2 000稀釋)孵育1 h，然后依次添加增色劑，用軟件對光學(xué)密度進(jìn)行分析。

表1 慢病毒轉(zhuǎn)載引物

2 結(jié)果

2.1經(jīng)轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞增殖情況與空白組比較，miRNA-143轉(zhuǎn)染組和MALAT1轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染組HeLa細(xì)胞增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 HeLa細(xì)胞中miRNA-143與MALAT1的表達(dá)情況

注: 與空白組比較，*P<0.05。

2.2不同時(shí)間轉(zhuǎn)染組HeLa細(xì)胞的侵襲情況不同轉(zhuǎn)染條件下HeLa細(xì)胞的增殖中，與miRNA-143轉(zhuǎn)染組比較，miRNA-143抑制劑轉(zhuǎn)染組侵襲性更強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與MALAT1抑制劑轉(zhuǎn)染組比較，MALAT1轉(zhuǎn)染組侵襲性更強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

2.3HeLa細(xì)胞在不同轉(zhuǎn)染條件下細(xì)胞的入侵和遷移情況采用反式分析方法檢測HeLa細(xì)胞的入侵和遷移，與miRNA-143轉(zhuǎn)染組比較，miRNA-143抑制劑轉(zhuǎn)染組HeLa細(xì)胞的入侵和遷移能力增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ，見圖1-5。

表3 不同時(shí)間轉(zhuǎn)染組HeLa細(xì)胞的侵襲情況

注: 0 h后與空白組對照比較，*P<0.05; 24 h后與空白組對照比較，#P<0.05; 48 h后與空白組對照比較，△P<0.05。

2.4miRNA-143轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞蛋白分析與miRNA-143轉(zhuǎn)染組比較，miRNA-143抑制劑轉(zhuǎn)染組e-cadherin水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與MALAT1抑制劑轉(zhuǎn)染組比較，MALAT1轉(zhuǎn)染組的vimentin水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6、表4。

組別E-cadherinVimentinmiRNA-143轉(zhuǎn)染組3.57±1.63*0.86±0.08*MALAT1轉(zhuǎn)染組1.06±0.11*2.15±1.05*miRNA-143抑制劑組1.02±0.12*2.34±1.16*MALAT1抑制劑組3.78±1.75*0.78±0.07*空白組1.38±0.221.26±0.18

注: 與空白組比較，*P<0.05。

3 討論

隨著宮頸癌篩查技術(shù)的發(fā)展，宮頸癌早期患者較前有所增加，但宮頸癌患者的發(fā)病率及死亡率未見明顯下降。因此，了解宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的機(jī)制是非常重要的。有學(xué)者的研究結(jié)果提示miRNA-143可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[4]。MALAT1是首先在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)[5]，作為一種長鏈非編碼RNA，它在各種腫瘤和組織中表達(dá)，可能影響腫瘤的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移[6]

本研究選擇了人類宮頸癌細(xì)胞株，HeLa細(xì)胞株作為模型。經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)經(jīng)轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞增殖與空白組比較，結(jié)果提示miRNA-143和MALAT1的表達(dá)對腫瘤的侵襲和增殖有影響。miRNA-143在細(xì)胞增殖中的存在負(fù)調(diào)控機(jī)制[7]。MALAT1也已被證明可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移[8]。在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中，惡性腫瘤細(xì)胞獲得成纖維細(xì)胞的形態(tài)特征[9]。EMT的顯著特征是它下調(diào)不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的間充質(zhì)，從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解[10]。鈣粘蛋白是一個(gè)Ca2+依賴的細(xì)胞內(nèi)跨膜糖蛋白粘附在上皮組織的分子，參與建立細(xì)胞連接。本研究發(fā)現(xiàn)了miRNA-143抑制劑轉(zhuǎn)染過程中，e-cadherin水平降低，與MALAT1抑制劑轉(zhuǎn)染組的水平相比，MALAT1轉(zhuǎn)染組的vimentin水平升高。本研究結(jié)果與Ying等人[11]的結(jié)論一致，即MALAT1移植鈣粘蛋白的表達(dá)和β-catenin，促進(jìn)間充質(zhì)轉(zhuǎn)變上皮細(xì)胞，調(diào)控結(jié)直腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移。

盡管本研究揭示了一些問題，但在分子機(jī)制分析中使用的Giemsa染色方法不是最優(yōu)的方法[12]，因?yàn)樗枰褂霉潭?xì)胞，脫色和染色過程對基質(zhì)細(xì)胞是有影響的。因此，在后續(xù)的研究中，我們將采用結(jié)晶紫染色法避免Giemsa染色可能出現(xiàn)的問題。此外，由于本研究中只使用了一個(gè)宮頸癌細(xì)胞系，再后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可以使用其它宮頸癌細(xì)胞系證實(shí)所發(fā)現(xiàn)的問題?？傊?，低水平的mirna-143和高水平的MALAT1可以增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞的增殖，因此，mirna-143與MALAT1可能是宮頸癌轉(zhuǎn)移的新標(biāo)記物，仍需要進(jìn)一步的研究去探究其機(jī)制。

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