老年大鼠海馬TLR4通路在脛骨手術(shù)導(dǎo)致的術(shù)后認知功能障礙中的作用研究

何 毅， 于嬋娟， 劉亞華

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科， 烏魯木齊 830011)

術(shù)后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction, POCD)是患者術(shù)后常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)并發(fā)癥之一，目前機制尚不清楚[1]。手術(shù)創(chuàng)傷可激活多種免疫細胞，如樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等。這些免疫細胞釋放的炎性因子導(dǎo)致過度的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而影響神經(jīng)遞質(zhì)的合成，突觸可塑性或產(chǎn)生神經(jīng)毒性，并造成認知功能障礙[2]。Toll樣受體是模式識別受體中的一類，可以識別不同的病原相關(guān)分子模式而啟動相應(yīng)的免疫應(yīng)答；Toll樣受體4(TLR4)信號通路的關(guān)鍵蛋白為核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB蛋白)、生存素(Survivin)蛋白[3]。本研究擬觀察大鼠行脛骨骨折手術(shù)后行為學(xué)改變，外周血中炎性介質(zhì)水平變化與海馬區(qū)TLR4通路關(guān)鍵蛋白的表達量，為防治術(shù)后認知功能障礙提供實驗學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗材料老年(>20月)健康雄性Wistar大鼠20只，鼠齡(22±1)月，體質(zhì)量(550±92)g(北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2014-0004)。水迷宮設(shè)備(上海欣軟信息科技有限公司)，七氟醚(規(guī)格：每瓶120 mL，批號：20150809，江蘇恒瑞制藥有限公司)，低溫離心機(美國Beckman公司)，低溫冰箱(日本HITACHI公司)，96孔酶標板(長沙晶美公司)，酶標儀(芬蘭LABSYSTEMS公司)，酶標洗板機(芬蘭LABSYSTEMS公司)，酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺二鹽酸(TMB)底物反應(yīng)溶液12 mL(美國R&D公司)，生存素(Survivin)、NF-κB(Santa Cruz)羊抗鼠二抗(武漢博士德)。

1.2方法

1.2.1 POCD模型的建立 將Wistar大鼠隨機分為對照組與手術(shù)組(每組10只)。保持飼養(yǎng)環(huán)境清潔與干燥，12 h晝夜生活，相對濕度(45±5)%，室溫維持在(25±2)℃。對2組大鼠進行3 d的Morris水迷宮(MWM)訓(xùn)練，使2組大鼠在MWM中達到同質(zhì)性[4-6]。記錄大鼠的逃避潛伏期時間、尋找平臺路徑的游泳長度、游泳速度以及在第3象限停留的時間。第4天，對手術(shù)組老年大鼠行脛骨骨折內(nèi)固定術(shù)。先對手術(shù)組大鼠行七氟醚麻醉，根據(jù)大鼠是否活動及對疼痛的反應(yīng)判斷麻醉深度，適時追加麻醉藥劑量，后在脛骨中點處切開皮膚及分離皮下組織，用骨剪橫向剪斷脛骨，隨后放置髓內(nèi)釘固定，逐層縫合。術(shù)后給予腹腔內(nèi)注射丁丙諾啡0.05～0.1 mg/kg進行術(shù)后鎮(zhèn)痛，對照組老年大鼠僅行麻醉、鎮(zhèn)痛處理。于術(shù)后1～5 d的相同時間點再次行MWM測試，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.2.2 術(shù)后老年大鼠外周血白介素-1β(IL-1β)、白介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達量的檢測 分別于術(shù)前1天、術(shù)后1、3、5 d早晨9點空腹采集大鼠血液，采血時取老年大鼠尾正中靜脈血2 mL，靜置30 min，以4 000 r/min離心10 min，取上清液，放入-80℃冰箱中備用。每份上清液被平均分成3份，采用ELISA法檢測IL-1β、IL-10和TNF-α水平，操作流程嚴格按試劑盒說明書進行。

1.2.3 Western blotting法測定海馬NF-κB蛋白、Survivin蛋白表達量 術(shù)后第5天，于MWM測試后,2組大鼠斷頭取海馬組織，剪碎，加入0.25%的胰酶15 min，然后給予3 mg/mL的I型膠原酶，2～3 h后，以3 500 r/min離心3 min。使用細胞過濾器過濾后，放入離心機中，以9 000 r/min離心5 min，取其上清液，冷藏備用。將收集到的上清液，加入裂解液于4℃靜置2 h后，以3 000 r/min離心15 min，取上清液。用 Bradford 法測定蛋白濃度，用BCA法進行蛋白定量后濃度均一化，取35 μg蛋白12%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂牛奶常溫搖床封閉2 h后PBS洗滌，加入HPR標記羊抗鼠IgG (1∶5 000稀釋)，室溫下孵育45 min，PBST洗滌。用ECL發(fā)光顯色檢測蛋白表達；Quantity One軟件進行相對定量分析。

2 結(jié)果

2.1POCD模型的建立手術(shù)組大鼠在不同時點的逃避潛伏期所需的時間無明顯改變，與同時點的對照組大鼠相比，手術(shù)組大鼠術(shù)后3～5 d逃避潛伏期所需的時間明顯延長(P<0.05)；在測試游泳路徑方面，術(shù)后第3天手術(shù)組大鼠尋找平臺所需的游泳路徑與對照組相比明顯延長(P<0.05)，術(shù)后第4、5天，雖然手術(shù)組大鼠尋找平臺所需的游泳路徑與前3 d比較有所減少，但仍長于對照組(P<0.05)；在術(shù)后第1～5天，2組大鼠尋找平臺的游泳速度比較無差異，說明大鼠行為學(xué)的改變與游泳速度無關(guān)。在空間探索能力上，對照組大鼠在第3象限的停留時間為(31.2±5.5)s，手術(shù)組大鼠在第3象限停留時間為(17.0±2.9)s，較前者明顯縮短(P<0.05),見表1。

2.2手術(shù)對老年大鼠外周血炎性因子表達量的影響手術(shù)組IL-1β、IL-10和TNF-α在術(shù)后1、3、5 d 先升高再逐漸減低，第1天和3天均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，第5天較對照組無差異(P>0.05)。對照組各時間點比較無差異(P>0.05),見表2。

表1 2組大鼠逃避潛伏期時間、游泳路徑及游泳速度

注：與對照組比較，*P<0.05。

表2 2組IL-1β、IL-10、TNF-α在血液中表達的含量測定值

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3手術(shù)對大鼠海馬NF-κB蛋白、Survivin蛋白表達量的影響術(shù)后第5天，用Western blotting法測得2組大鼠的海馬組織中NF-κB蛋白、Survivin蛋白印跡表達如圖1，通過灰度值比較，手術(shù)組NF-κB、Survivin含量均降低。對照組與手術(shù)組中NF-κB蛋白含量分別為(0.084±0.005)、(0.056±0.003)(P<0.05)，Survivin蛋白含量分別為(0.230±0.02)、(0.174±0.006)(P<0.05)，提示TLR4下游通路可能被抑制。

3 討論

POCD的發(fā)生率很高，在老年病人群體中尤為明顯[7]，對其機制進行深入探討具有重要的社會價值和經(jīng)濟意義[8]。POCD的發(fā)生、發(fā)展可由多種因素協(xié)同造成，比如高血壓、藥物濫用、過度飲酒[9]、精神因素等。研究表明[10]，外周炎性因子的表達量增加，通過特定途徑進入CNS，特別是海馬區(qū)，會導(dǎo)致長時程增強減弱，破壞突觸的可塑性，從而引發(fā)認知功能減退。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)，與對照組大鼠相比，手術(shù)組大鼠術(shù)后外周血的IL-1β、IL-10、TNF-α的含量增加。而這些炎癥因子表達量的增加與大鼠術(shù)后行為學(xué)的減退一致，同時伴隨海馬內(nèi)TLR4通路關(guān)鍵蛋白NF-κB蛋白、Survivin蛋白的表達量降低。由此推測，手術(shù)創(chuàng)傷產(chǎn)生的炎癥因子通過抑制海馬TLR4信號通路的相關(guān)蛋白標記物表達，引發(fā)并加重中樞炎癥，與POCD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

TLR4作為參與天然免疫的模式識別受體，能識別組織損傷后釋放的內(nèi)源性分子，啟動下游一系列通路，并表達多種炎性因子，在炎癥中發(fā)揮重要作用[11]。TLR4廣泛分布于單核/巨噬細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞以及中樞的小膠質(zhì)細胞。在本實驗中，手術(shù)創(chuàng)傷引發(fā)外周血釋放大量的炎性物質(zhì)(IL-1β、IL-10、TNF-α)，這些炎癥因子通過血腦屏障進入CNS后引起POCD，同時反饋性抑制了TLR4通路相關(guān)蛋白的表達。由于大鼠術(shù)后出現(xiàn)了明顯行為學(xué)的改變，因此推測POCD可能與老年大鼠海馬TLR4通路被抑制有關(guān)。

在本研究中，老年大鼠在術(shù)中可能存在缺氧、低血壓等問題，而這些因素亦是POCD發(fā)生的危險因素。另外，我們摘取的是術(shù)后第5天的大鼠海馬組織，無法檢測術(shù)后1天、3天海馬區(qū)NF-κB蛋白、Survivin蛋白的表達量，從而不能顯示這兩個蛋白的動態(tài)變化過程。最后，若能直接檢測海馬區(qū)TLR4的蛋白表達量，結(jié)果則更加具有說服力。

綜上所述，脛骨手術(shù)引發(fā)的外周炎癥介質(zhì)釋放通過抑制TLR4通路關(guān)鍵蛋白NF-κB和Survivin蛋白的表達化來引發(fā)POCD。

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