睡蓮花isostrictiniin對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷防護(hù)作用及其體外抗氧化活性研究

麥爾旦·吐?tīng)栠d麥麥提，劉 濤，李晨陽(yáng)，徐 芳，趙 軍

(新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院， 2公共衛(wèi)生學(xué)院，烏魯木齊 830011；3新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830004)

睡蓮花為睡蓮科睡蓮屬多年生水生草本植物雪白睡蓮(NymphaeacandidaPresl)的干燥花蕾，主要生長(zhǎng)在我國(guó)新疆阿勒泰、博湖及伊犁等地區(qū)[1]，具有降熱止咳、益心護(hù)腦、安神止痛之功效，臨床多用于治療感冒發(fā)燒、頭痛咳嗽、心悸不安、咽痛解毒等[2,3]。睡蓮花中主要化學(xué)成分為多酚類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物，其中煙花苷、isostrictiniin等化合物是含量較高的特征性成分。本課題組前期研究表明睡蓮花總黃酮提取物及其黃酮類(lèi)成分煙花苷具有較好的保肝作用[4-6]。本研究采用體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)以及四氯化碳(CCl4)致小鼠急性化學(xué)性肝損傷模型來(lái)評(píng)價(jià)睡蓮花中isostrictiniin的生物活性，為揭示睡蓮花的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器BS-450型自動(dòng)生化分析檢測(cè)儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療有限公司)；UV-754型紫外可見(jiàn)分光光度儀(上海菁華科技儀器有限公司)；RT-6100型酶標(biāo)儀(深圳雷社生命科學(xué)有限公司)；TGL-16M型冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；HH型恒溫水浴鍋(金壇科析儀器有限公司)。

1.2試劑聯(lián)苯雙酯滴丸(北京協(xié)和制藥廠，批號(hào)0505010r7)；四氯化碳(天津永晟化學(xué)試劑廠，批號(hào)20151101)；總蛋白定量(BCA法)、MDA、SOD、GSH和NO檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20151219、20151207、20150610、20151112、20150605)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：STBC5116V)；其它試劑均為分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)昆明種小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SYXK(新)2011-0001，使用許可證號(hào)SYXK(新)2011-0001。

1.4藥材睡蓮花藥材購(gòu)自新疆維吾爾藥業(yè)有限公司，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所何江副研究員鑒定為睡蓮科睡蓮屬多年生水生草本植物雪白睡蓮(NymphaeacandidaPresl)的干燥花蕾。

2 方法

2.1isostrictiniin的提取方法稱取睡蓮花藥材10.0 kg，以10倍量70%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液減壓濃縮至浸膏。浸膏以水混懸后上D101型大孔吸附樹(shù)脂柱，先以10倍量去離子水洗脫，再以5個(gè)柱體積的30%乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮至浸膏。將浸膏以適量甲醇溶解，聚酰胺拌樣，上聚酰胺柱，用不同濃度乙醇溶液梯度洗脫，收集60%乙醇洗脫溶液，減壓濃縮干燥得浸膏，浸膏以水溶解后經(jīng)MCI gel CHP 20P柱反復(fù)純化，得到白色粉末，即isostrictiniin，經(jīng)高效液相色譜歸一化法測(cè)定其純度為98.7%。

2.2isostrictiniin的抗氧化能力測(cè)定

2.2.1 鐵離子還原能力的測(cè)定[7]在具塞試管中分別先后加入磷酸緩沖溶液(pH=7.4)2.5 mL、isostrictiniin(10、20、30、40、50 μg/mL)1.0 mL和1%鐵氰化鉀溶液1.0 mL，混合均勻；反應(yīng)20 min(50℃恒溫)后，室溫冷卻，分別加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL和蒸餾水4.0 mL后，再加入1.0 mL的0.1%三氯化鐵溶液，混勻。對(duì)照組加入同濃度的Vc代替isostrictiniin溶液。靜置10 min后，測(cè)定700 nm處吸光度。

2.2.2 DPPH·的清除能力測(cè)定 將不同濃度的isostrictiniin溶液(5、10、20、30、40、50、70、100 μg/mL)0.5 mL加入到2.5 mL濃度6.5×10-5mol/L DPPH溶液中，混勻。對(duì)照組加入同濃度的Vc代替isostrictiniin溶液。靜置15 min，測(cè)定517 nm處吸光度，計(jì)算DPPH清除率及IC50值。清除率(Y)按下式計(jì)算：Y=[1-(Aj-Ak)/Am]×100%(式中Am、Aj、Ak分別為DPPH乙醇溶液與水混合液、試樣混合液和DPPH乙醇溶液、試樣混合液和乙醇溶液在517 nm處的吸光度值)[8]。

2.2.3 總抗氧化能力測(cè)定(FRAP法) 取濃度為300 mmol/L pH=3.6的醋酸鹽緩沖液25 mL，加入濃度為 10 mmol/L 的TPTZ溶液2.5 mL，再加入濃度為 20mmol/L 的FeCl3混合溶液2.5 mL，混勻即得FRAP工作液。分別移取 0.1、0.2、0.3、0.4和0.6 mmol/L的FeSO4溶液 0.2 mL于反應(yīng)管中，先后加入6.0 mL FRAP工作液和0.6 mL 蒸餾水，37 ℃下水浴10 min，在593 nm處測(cè)定吸光度A，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，F(xiàn)eSO4溶液(mmol/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在0.1～0.6 mmol/L范圍內(nèi)FeSO4的濃度與吸光度呈線性關(guān)系，線性回歸方程為:Y=1.607 8X+0.057 5 (r=0. 999)。分別準(zhǔn)確移取0.5 mL不同濃度的isostrictiniin溶液和Vc溶液(10、20、30、40、50 μg/mL)于反應(yīng)管中，加入6.0 mL FRAP工作液和0.6 mL去離子水，混合均勻，10 min在37 ℃的條件下反應(yīng)后用紫外在593 nm處測(cè)定吸光度A。根據(jù)A值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得相應(yīng)FeSO4的濃度(mmol/L)，即FRAP 值[9]。將樣品溶液和對(duì)照溶液的A值代入FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得 FRAP值(mmol/ L)。得到的 FRAP值(mmol/ L)為縱坐標(biāo)，樣品溶液和對(duì)照溶液的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制曲線，進(jìn)行比較。

2.3Isostrictiniin對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷的防治作用

2.3.1 CCl4致小鼠急性肝損傷模型的建立及給藥 根據(jù)文獻(xiàn)[10]的方法將昆明種小鼠60只，根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為isostrictiniin低、中、高劑量組(25、50、100 mg/kg)、正常對(duì)照組、模型組和聯(lián)苯雙酯對(duì)照組(150 mg/kg體質(zhì)量)。isostrictiniin組和聯(lián)苯雙酯對(duì)照組每日1次按體質(zhì)量0.1 mL/10 g灌胃給藥，其余組的小鼠每日1次按體質(zhì)量0.1 mL/10 g灌胃去離子水，7 d連續(xù)地灌胃。最后1次給藥后，除花生油溶液(0.1 mL/10 g體質(zhì)量)注射空白組小鼠的腹腔外，其余各組小鼠腹腔均注射0.1% CCl4花生油溶液(0.1 mL/10 g體質(zhì)量)。禁食不禁水8 h后，摘眼球取血，放置2 h后，3 000 r/min離心10 min，吸取血清備檢各項(xiàng)生化指標(biāo)。脫頸處死小鼠，取小鼠肝臟和脾臟，稱重，計(jì)算肝臟(或脾臟)指數(shù)：臟器系數(shù)=臟器濕重(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)。精確稱取0.5 g肝臟置于冷生理鹽水中，用濾紙把水分吸干后，按1∶9(質(zhì)量體積比)加入生理鹽水4.5 mL，冰浴研磨至混濁的漿狀，3 000 r/min離心10 min，取肝勻漿上清液檢測(cè)生化指標(biāo)。

2.3.2 生化指標(biāo)檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清ALT和AST水平；按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)肝勻漿MDA、SOD、GSH和NO含量。

2.3.3 病理學(xué)檢查 小鼠處死后，取肝臟左葉距邊緣0.5 cm處的小塊組織，10%甲醛溶液中固定，HE染色法制作切片，40×10倍光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

3 結(jié)果

3.1isostrictiniin的抗氧化能力

3.1.1 isostrictiniin對(duì)鐵離子的還原能力 隨著isostrictiniin和Vc的濃度在(10 ～50 μg/mL)范圍內(nèi)增大，其吸光度值不斷增加，對(duì)Fe3+還原能力不斷增強(qiáng)，呈現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)依賴關(guān)系，且isostrictiniin的還原能力強(qiáng)于Vc，見(jiàn)圖1。

3.1.2 isostrictiniin對(duì)DPPH·的清除能力 Isostrictiniin對(duì)DPPH有較強(qiáng)的清除作用，與Vc的清除作用相等，并且呈現(xiàn)出的量效關(guān)系也良好，isostrictiniin與Vc的IC50值分別為8.95和6.33 μg/mL，見(jiàn)圖2。

3.1.3 isostrictiniin的總抗氧化能力 FRAP值隨樣品濃度變大而變大，總抗氧化能力也變強(qiáng)。Isostrictiniin的總抗氧化能力與相同濃度下Vc的總抗氧化能力較當(dāng)，見(jiàn)圖3。

3.2isostrictiniin對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷的防護(hù)作用與空白組比較，CCl4導(dǎo)致的急性化學(xué)性肝損傷的小鼠血清中ALT和AST活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，isostrictiniin中、高劑量組(50、100 mg/kg)小鼠血清中ALT和AST水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照聯(lián)苯雙酯。CCl4導(dǎo)致的肝損傷小鼠的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)升高，isostrictiniin中、高劑量組小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

3.3Isostrictiniin對(duì)CCl4致急性肝損傷小鼠肝勻漿MDA、SOD、GSH和NO的影響與空白組比較，模型組小鼠肝勻漿的MDA和NO水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SOD和GSH水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，isostrictiniin中、高劑量組(50、100 mg/kg)小鼠血清MDA和NO水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；小鼠血清SOD和GSH水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且效果接近于陽(yáng)性對(duì)照聯(lián)苯雙酯，見(jiàn)表2。

表1 isostrictiniin對(duì)CCl4致急性肝損傷小鼠血清ALT和AST及肝臟、脾臟指數(shù)的影響

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

表2 Isostrictiniin對(duì)CCl4致急性肝損傷小鼠肝勻漿MDA、SOD、GSH和NO的影響

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01.

3.4isostrictiniin對(duì)CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響正常對(duì)照組小鼠肝臟組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)清楚，肝小葉的結(jié)構(gòu)完整，肝臟組織細(xì)胞索的排列方式是呈放射狀(圖4A)。模型組小鼠的肝臟組織細(xì)胞有水腫、細(xì)胞質(zhì)變疏松，呈氣球樣變，也能看到紊亂的肝臟細(xì)胞索排列，并且肝臟組織細(xì)胞脂肪的變性也可多見(jiàn)、碎片狀和點(diǎn)狀壞死等，且可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4B)。聯(lián)苯雙酯對(duì)照組小鼠肝臟組織細(xì)胞水腫不明顯，匯管區(qū)有少量浸潤(rùn)的炎細(xì)胞，有很少的點(diǎn)狀壞死(圖4C)。與模型對(duì)照組比較，isostrictiniin不同劑量組有效地改善了CCl4致導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝臟組織細(xì)胞的病變程度，其中高劑量組(100 mg/kg，圖4D)小鼠肝臟病理組織的改善明顯，肝臟細(xì)胞水腫減輕，壞死的肝臟細(xì)胞數(shù)量減少，變性的肝臟細(xì)胞脂肪數(shù)少，偶見(jiàn)浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞，肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，見(jiàn)圖4。

A.空白組

B. 模型組

C. DDB (150 mg/kg)

D. isostrictiniin (100 mg/kg)

E. isostrictiniin (50 mg/kg)

F. isostrictiniin (25 mg/kg)

圖4Isostrictiniin對(duì)CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織病理切片的光鏡觀察(HE染色,×400)

4 討論

鐵離子還原能力、DPPH·清除實(shí)驗(yàn)以及FRAP法是抗氧化活性成分篩選的常用方法。本研究結(jié)果顯示isostrictiniin具有較好的總抗氧化能力、鐵離子還原能力及DPPH·清除能力，其抗氧化活性幾乎與Vc相當(dāng)。CCl4作為是一種對(duì)肝細(xì)胞有嚴(yán)重毒性的化學(xué)物質(zhì)，CCl4致肝損傷的機(jī)制與其自身及代謝產(chǎn)物有關(guān)。在肝組織內(nèi)細(xì)胞色素P450作用下，CCl4代謝產(chǎn)生三氯甲烷自由基-CCl3。-CCl3刺激細(xì)胞產(chǎn)生活性中間產(chǎn)物，造成脂質(zhì)過(guò)氧化，并與肝細(xì)胞蛋白或DNA結(jié)合破壞肝細(xì)胞機(jī)能，造成生物膜結(jié)構(gòu)和功能損傷，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷壞死，胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST溢出，使血漿ALT、AST升高[9]。此外，CCl4自身的溶酶作用也可導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。CCl4在小鼠肝臟導(dǎo)致急性化學(xué)性損傷后，血清中ALT、AST的水平升高。預(yù)先給予isostrinctiniin(50、100 mg/kg)后，與模型組相比，小鼠血清中ALT、AST水平明顯降低，肝臟、脾臟指數(shù)下降，小鼠肝臟的病理?yè)p傷程度得到改善。此外，isostrictiniin各給藥組可提高SOD和GSH的活性，降低NO含量。中高劑量組的isostrictiniin還能降低MDA的含量。上述數(shù)據(jù)表明isostrictiniin有保肝降酶作用，還可抑制肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，提示其作用機(jī)制可能與其抗氧化作用有關(guān)，對(duì)睡蓮花藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的揭示及開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。

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