結(jié)核感染T細(xì)胞斑點實驗在結(jié)核病診斷中的價值

徐 茜， 賀家勇， 常 煒， 甫拉提·熱西提， 王 松

(1新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室, 烏魯木齊 830011; 2中國石油烏魯木齊石油化工總廠職工醫(yī)院外一科, 烏魯木齊 830019;3新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院, 烏魯木齊 830054; 4新疆維吾爾自治區(qū)胸科醫(yī)院胸外中心， 烏魯木齊 830049)

據(jù)世界衛(wèi)生組織估算，全世界感染結(jié)核分支桿菌占1/3的人口，每年新增有結(jié)核病患者800萬例，其中死亡200萬例[1]。結(jié)核病早期診斷和治療是控制結(jié)核傳播的關(guān)鍵[2]。結(jié)核菌素試驗(PPD)是目前臨床常常采用診斷結(jié)核的方法之一，但結(jié)核菌素與卡介苗會存在交叉免疫源性，會產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)，其在結(jié)核病中的診斷價值存在局限性。在活動性肺結(jié)核患者中，約有40%～60%的肺結(jié)核患者結(jié)核菌陰性，因此，采用痰抗酸桿菌的方法診斷比較困難[4-5]。痰結(jié)核菌培養(yǎng)是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，但其耗時較長，不能用于早期診斷結(jié)核病。結(jié)核菌感染T細(xì)胞斑點實驗(T-SPOT.TB)是γ干擾素釋放試驗的一種，是近年來產(chǎn)生的新的檢測技術(shù)[6-7]。本研究分別對60例確診痰菌種陰性及34例痰菌陽性肺結(jié)核患者和30例非結(jié)核病，采用3種檢測方法，即T-SPOT.TB、結(jié)核分枝桿菌DNA測定(TB-DNA)和結(jié)核菌素皮試(TST)進(jìn)行檢測，評價與對比T-SPOT.TB在痰菌陰性與痰菌陽性肺結(jié)核病中的診斷價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料收集新疆維吾爾自治區(qū)胸科醫(yī)院痰結(jié)核桿菌陰性肺結(jié)核患者60例(痰菌陰性組)，其中男性33例，女性27例，年齡22～75歲。診斷符合2006年中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會制定的“肺結(jié)核診斷和治療指南”中菌陰活動性肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]?；颊?次涂片1次培養(yǎng)菌陰性。另納入痰結(jié)核桿菌陽性肺結(jié)核患者34例為痰菌陽性組，其中男性18例，女性16例，年齡24～79歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)肺結(jié)核病復(fù)治者或初治患者治療≥2 w患者；(2)存在獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、肝炎、糖尿病及其他免疫功能異常者；(3)孕婦、哺乳期婦女。另納入肺癌、慢性阻塞性肺疾病和支氣管肺炎患者共35例，為非結(jié)核病組，其中男性17例，女性18例，年齡25～81歲。3組患者一般資料中性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性,各組一般資料的比較見表1。

1.2T-SPOT.TB實驗方法采用酶聯(lián)免疫斑點實驗(ELISPOT)行T-SPOT.TB檢查?；颊呷朐簷z查，抽取8 mL外周血，分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。試劑盒為英國Oxford Zmmunote公司產(chǎn)品，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行試驗。配置 250萬細(xì)胞/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取出微量板，以細(xì)胞培養(yǎng)液為陰性對照，陽性對照加入植物血凝素，剩余2孔分別加入50 μL抗原A和抗原B，分別含抗原A(ESAT-6)和抗原B(CFP-10)，每孔加入含有25萬PBMC的上述細(xì)胞懸液100 μL，將微量板置于CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育16～20 h，PBS液洗脫，加入生物標(biāo)記的抗IFN-γ單克隆抗體50 μL，4℃中孵育2 h，采用PBS液洗脫，酶聯(lián)顯色，記錄斑點數(shù)。根據(jù)抗原A和(或)抗原B的反應(yīng)孔的斑點數(shù)進(jìn)行判斷。陽性、陰性對照孔斑點數(shù)為0～5，陽性樣本應(yīng)為[(抗原A或抗原B斑點數(shù))-(陰性對照孔斑點數(shù))]≥ 6；陰性對照孔斑點數(shù)≥6，陰性樣本應(yīng)為：(抗原A或抗原B斑點數(shù))≥2×(陰性對照孔斑點數(shù))。

表1 3組一般資料的比較

1.3TST檢測方法入院時，于患者前臂皮內(nèi)注射結(jié)核菌素純化蛋白衍生物(PPD)0.1 mL，72 h后查驗結(jié)果及卡痕，以硬結(jié)直徑<5 mm為陰性，硬結(jié)直徑≥10 mm為陽性。

1.4TB-DNA檢測采用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行TB-DNA檢測，運用定量PCR對TB-DNA進(jìn)行檢測，TB-DNA熒光PCR檢測試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因公司提供，具體操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1T-SPOT.TB檢測結(jié)果3組T-SPOT.TB陽性率經(jīng)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。肺結(jié)核組(包括痰菌陰性組、痰菌陽性組)的T-SPOT.TB陽性率均明顯高于非結(jié)核組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。痰菌陰性組和痰菌陽性組T-SPOT.TB陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.207，P=0.272)。痰菌陰性組和非結(jié)核組T-SPOT.TB陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=38.033，P=1.207)，見表2。

表2 各組患者結(jié)核感染T細(xì)胞斑點實驗(T-SPOT.TB)檢測結(jié)果

注：痰菌陰性組vs痰菌陽性組(χ2=1.207，P=0.272)；痰菌陰性組vs非肺結(jié)核組(χ2=38.033，P=1.207)；痰菌陽性組vs非肺結(jié)核組(χ2=35.945，P=0.000)。

2.2單一檢測方法對診斷肺結(jié)核的價值評價單一指標(biāo)檢測肺結(jié)核，T-SPOT.TB的敏感性和特異型分別為88.3%和94.3%，其敏感性高于TST和TB-DNA，經(jīng)統(tǒng)計分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；特異性低于TST，而高于TB-DNA，見表3、表4。

表3 肺結(jié)核組中T-SPOT.TB、TST和TB-DNA 3種檢測方法的結(jié)果

注：*T-SPOT.TB與TST、TB-DNA比較的χ2值和P值。

表4 非肺結(jié)核病組中T-SPOT.TB、TST和TB-DNA 3種檢測方法的結(jié)果

注：*T-SPOT.TB與TST、TB-DNA比較的χ2值和P值。

3 討論

結(jié)核的診斷一直受臨床醫(yī)生的關(guān)注。近年來，T細(xì)胞的γ干擾素釋放試驗在結(jié)核病診斷領(lǐng)域取得重要進(jìn)展[8-9]，其采用結(jié)核桿菌所特有抗原早期分泌抗原靶蛋白(ESAT-6)和培養(yǎng)濾過蛋白-10(CFP-10)刺激機體T細(xì)胞釋放IFN-γ，T-SPOT.TB是目前IFN-γ體外釋放實驗診斷結(jié)核分枝桿菌感染最主要的辦法。T-SPOT.TB應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)(ELISPOT)檢測，經(jīng)結(jié)核特異性抗原ESAT-6和FP-10刺激后外周血單個核細(xì)胞IFN-γ分泌，并經(jīng)一系列反應(yīng)后比較斑點顯示的效果。T-SPOT.TB對于結(jié)核的輔助診斷值較高，Lee 等[10]的前瞻性研究結(jié)果提示 T-SPOT.TB 診斷結(jié)核的敏感性和特異性分別為 96.6%和84.7%。Dai 等[11]通過Meta 分析研究顯示，T-SPOT.TB 對結(jié)核診斷的敏感性為88%，特異性為 89%。本研究結(jié)果顯示，T-SPOT.TB對結(jié)核診斷的敏感性為88.3%，特異性為94.3%，與上述文獻(xiàn)報道相一致。

本研究采用3種方法檢測其在結(jié)核病檢測中的臨床應(yīng)用價值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核組(包括痰菌陰性組、痰菌陽性組)的T-SPOT.TB陽性率均明顯高于非結(jié)核組，T-SPOT TB、TST和TB-DNA在肺結(jié)核中的敏感性分別為88.3%、31.9%和69.1%，特異性分為94.3%、100%和91.4%。在3種檢測方法中，TST檢測的敏感性最低。雖然TST是公認(rèn)的快速診斷肺結(jié)核感染的有效手段，但其檢測的敏感性比較低的可能原因為：對于免疫力低下的結(jié)核患者，其敏感性會有所降低，所以TST在TB的診斷中也存在一定的局限性。TB-DNA的敏感性、特異性界于TST和T-SPOT.TB之間，TB-DNA的陽性率受制于痰液中結(jié)核分枝桿菌數(shù)量，容易出現(xiàn)假陽性。另外TB-DNA檢測標(biāo)本來源不如T-SPOT.TB標(biāo)本源方便易得，對于不咯痰或不能接受支氣管鏡的患者，不易取得檢測標(biāo)本。T-SPOT.TB在痰菌陽性和陰性標(biāo)本的陽性檢測率分別為85.0%和94.1%，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可見T-SPOT.TB的敏感性與患者是否排菌、排菌類型及排菌數(shù)量多少無關(guān)，可以成為結(jié)核病早期診斷的輔助檢查手段。T-SPOT.TB由于其檢測的是外周血中結(jié)核特異性釋放IFN-γ的淋巴細(xì)胞的數(shù)量，因而也不會受到個體細(xì)菌學(xué)檢測結(jié)果的影響，在肺結(jié)核診斷菌陰肺結(jié)核中，T-SPOT.TB檢測顯得更有輔助價值。

肺結(jié)核涂陽僅占肺結(jié)核發(fā)病例數(shù)的約50%，涂陰肺結(jié)核的診斷及非結(jié)核分枝桿菌感染率上升，給T-SPOT.TB提供利用空間，其不僅可節(jié)約診斷時間，而且有較高的敏感性、特異性，是較為有效的輔助診斷方法。

需要注意的是，T-SPOT.TB陽性結(jié)果不能作為單獨或是決定性的診斷結(jié)核病的依據(jù)，無法診斷潛伏感染和活動性肺結(jié)核；除病原學(xué)確診外，結(jié)核病的診斷需要結(jié)合臨床表現(xiàn)、實驗室檢查、影像學(xué)結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。

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