IL-1β促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移和侵襲的實(shí)驗(yàn)研究

李 魯, 周 劍， 劉 濤， 劉 清， 鄭樹濤， 譚豆豆， 陳玉梅， 馬 蓉， 盧曉梅

(新疆醫(yī)科大學(xué)1第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心, 2附屬腫瘤醫(yī)院， 3臨床醫(yī)學(xué)研究院， 烏魯木齊 830011)

食管癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率和死亡率分別排在第8位和第6位[1]。食管癌的組織學(xué)類型包括腺癌和鱗狀細(xì)胞癌，我國(guó)90%的食管癌屬于食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)[2]。ESCC常發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，患者5 a生存率不足20%[3]。白細(xì)胞介素1-β(IL-1β)是一種促炎細(xì)胞因子，在炎癥、機(jī)體免疫反應(yīng)和維持組織穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β與多種腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，對(duì)腫瘤的遷移和侵襲具有促進(jìn)作用[4-5]。本研究用IL-1β處理ESCC細(xì)胞，觀察IL-1β對(duì)ESCC細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料食管鱗狀細(xì)胞癌Eca109細(xì)胞(武漢大學(xué)細(xì)胞庫(kù))和KYSE-150細(xì)胞(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院贈(zèng)送)?？贵w芯片(AAH-CYT-G5, 北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司)。IL-1β(北京神州義翹科技有限公司)，蛋白質(zhì)抽提試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(Gibco公司)，DMSO (Invitrogen公司)。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)上清的制備 食管癌Eca109細(xì)胞和KYSE-150細(xì)胞在37℃，5%CO2條件培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)、青霉素 (100 IU/mL)及鏈霉素 (100 IU/mL)的RPMI1640培養(yǎng)液中。建立食管癌細(xì)胞與M2 TAMs共培養(yǎng)體系，并將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，共培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液上清，采用蛋白質(zhì)抽提試劑盒制備細(xì)胞蛋白。食管癌細(xì)胞加M2 TAMs作為共培養(yǎng)組，正常培養(yǎng)食管癌細(xì)胞作為非共培養(yǎng)組。

1.2.2 抗體芯片篩查 采用AAH-CYT-G5抗體芯片及其檢測(cè)試劑盒，按試劑盒說明進(jìn)行操作。抗體芯片放置孵育盒中，加人2 mL封閉緩沖液，室溫振蕩孵育l h；每張芯片加入2 mL含1.2 mg蛋白質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液，4℃振蕩孵育過夜；去除樣品液，加入約2 mL的1×洗液I于室溫振蕩清洗；去除洗液I，加入1×洗液II于室溫振蕩清洗；去除洗液II，加入1 mL生物素標(biāo)記的混合抗體，于室溫孵育2 h；抽去洗液II，加入2 mL 5 000倍稀釋的熒光劑CW800標(biāo)記的鏈霉親和素，室溫避光振蕩孵育2 h；熒光掃描(Licor-Odyssey)獲取圖像(每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)。

1.2.3 IL-1β處理細(xì)胞 食管癌細(xì)胞Eca109細(xì)胞和KYSE150細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入IL-1β (100 ng/mL) 培養(yǎng)48 h，作為IL-1β處理組，加入PBS代替IL-1β作為未處理組(每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞接種于6孔板，恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用10 μL無菌槍頭在6孔板底部輕劃一條力度和角度一致、粗細(xì)均勻的直線(每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)。分別于0、24、48 h在倒置相差顯微鏡下觀察同一視野劃痕的寬度并拍照。

1.2.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 配制基質(zhì)膠，將配好的基質(zhì)膠加入到Transwell小室的上室，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜使其充分干燥。Transwell小室下室加入500 μL含10%FBS的1640培養(yǎng)基作為趨化劑，細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基混勻后加入上室面(5×104/孔)，置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，用棉簽輕輕擦去上室面未穿過膜的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，PBS清洗，結(jié)晶紫染色30 min后再用PBS清洗，顯微鏡下觀察，每個(gè)樣本隨機(jī)選取4個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野染色的細(xì)胞數(shù)量，即穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值(每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)。

2 結(jié) 果

2.1抗體芯片篩查細(xì)胞因子食管癌細(xì)胞與M2 TAMs共培養(yǎng)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用抗體芯片篩查共培養(yǎng)組與非共培養(yǎng)組細(xì)胞培養(yǎng)上清中差異表達(dá)的細(xì)胞因子(圖1a)。結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組培養(yǎng)上清中IL-1β表達(dá)增加，與非共培養(yǎng)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, 圖1b)。

2.2IL-1β對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響與未處理組比較，IL-1β處理48 h后細(xì)胞劃痕愈合能力明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) (圖2a),IL-1β處理相對(duì)寬度較未處理組窄，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)(圖2b)。

2.3IL-1β對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響與未處理組比較，IL-1β處理48 h后，穿過基膜的細(xì)胞數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001) (圖2c、d)，表明IL-1β處理能增強(qiáng)ESCC細(xì)胞的侵襲能力。

3 討論

本研究中，我們將食管癌細(xì)胞與M2 TAMs共培養(yǎng)，觀察共培養(yǎng)后細(xì)胞培養(yǎng)上清中差異表達(dá)的細(xì)胞因子對(duì)食管癌遷移、侵襲能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M2 TAMs與Eca109細(xì)胞及KYSE-150細(xì)胞共培養(yǎng)上清中IL-1β表達(dá)均顯著增加，與非共培養(yǎng)組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證IL-1β對(duì)ESCC細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，我們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)基中加入IL-1β，觀察IL-1β作用后對(duì)ESCC細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IL-1β處理48 h后Eca109細(xì)胞和KYSE-150細(xì)胞的遷移和侵襲能力均顯著增加，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。我們的研究結(jié)果表明，共培養(yǎng)后分泌增加的細(xì)胞因子IL-1β可顯著促進(jìn)ESCC細(xì)胞的遷移和侵襲。

腫瘤發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要原因。IL-1β是一種促炎細(xì)胞因子，IL-1β不僅與機(jī)體炎癥反應(yīng)有關(guān)，還在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，IL-1β表達(dá)增加[9]。同時(shí)IL-1β與其他免疫細(xì)胞一起形成炎性免疫微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤血管的形成，并通過釋放一些促瘤的細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-6(IL-6)和人生長(zhǎng)調(diào)節(jié)致癌基因α(GRO-α)等，促進(jìn)腫瘤發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[10-13]。另有研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β可引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)結(jié)腸癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[14]。我們的研究結(jié)果表明IL-1β刺激后，促進(jìn)ESCC細(xì)胞的遷移和侵襲，表明IL-1β在ESCC的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。

腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過程，本研究?jī)H通過細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了IL-1β在ESCC遷移和侵襲過程中的重要作用，IL-1β是否會(huì)引起食管癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，以及IL-1β導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制還有待于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

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