MCP2促進食管癌細胞遷移和侵襲的實驗研究

盧曉梅， 周 劍,， 鄭樹濤， 劉 濤， 劉 清， 馬 蓉,， 譚豆豆， 陳玉梅

(新疆醫(yī)科大學1附屬腫瘤醫(yī)院； 2臨床醫(yī)學研究院， 烏魯木齊 830011)

食管癌是我國十大惡性腫瘤之一，食管癌的發(fā)病率和致死率在我國惡性腫瘤中分別居于第5位和第4位[1]。食管癌的組織學類型包括鱗狀細胞癌和腺癌，我國90%的食管癌屬于食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)[2]。食管癌的病因復雜，遺傳和環(huán)境因素、飲食與生活習慣等都是食管癌發(fā)病的潛在危險因素[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中的趨化因子可通過與腫瘤細胞的相互作用，在腫瘤進展過程中起著重要作用[4]。

趨化因子是一種小分子低重量蛋白，可以結合特殊的G蛋白偶聯(lián)于細胞表面受體。趨化因子在腫瘤生長、侵襲轉移及免疫反應中起著重要作用[5-6]。巨噬細胞趨化蛋白2(macrophage chemoattractant protein2, MCP2)，屬于CC型趨化因子家族，研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、肺癌等腫瘤均表達MCP2蛋白，MCP2表達與腫瘤進展密切相關[7-9]。

本研究中先用抗體芯片技術，檢測M2 TAMs與ESCC共培養(yǎng)后差異表達的細胞因子及趨化因子，將篩選出的趨化因子MCP2加入ESCC培養(yǎng)基中，觀察MCP2刺激后對ESCC細胞遷移和侵襲能力的影響，探討MCP2在ESCC遷移和侵襲中的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料食管鱗狀細胞癌Eca109細胞購自武漢大學細胞庫，KYSE-150細胞由中國醫(yī)學科學院贈送?？贵w芯片(AAH-CYT-G5, 北京博奧晶典生物技術有限公司)，MCP2(北京神州義翹科技有限公司)，蛋白質(zhì)抽提試劑盒購自碧云天生物技術公司，胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(Gibco公司)，DMSO(Invitrogen公司)。

1.2方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)上清的制備 食管癌Eca109細胞和KYSE-150細胞在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)、青霉素 (100 IU/mL)及鏈霉素 (100 IU/mL) 的RPMI1640培養(yǎng)液中。建立食管癌細胞與M2 TAMs共培養(yǎng)體系，并將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，共培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液上清，采用蛋白質(zhì)抽提試劑盒制備細胞蛋白。以食管癌細胞加M2型TAMs為共培養(yǎng)組，以正常培養(yǎng)食管癌細胞為非共培養(yǎng)組。

1.2.2 抗體芯片篩查 采用AAH-CYT-G5抗體芯片及其檢測試劑盒，按試劑盒說明進行操作?？贵w芯片放置孵育盒中，加入2 mL封閉緩沖液，室溫振蕩孵育1 h; 每張芯片加入2 mL含1.2 mg蛋白質(zhì)的細胞培養(yǎng)上清和細胞裂解液，4℃振蕩孵育過夜; 去除樣品液，加入約2 mL的1×洗液Ⅰ于室溫振蕩清洗; 去除洗液Ⅰ，加入1×洗液Ⅱ于室溫振蕩清洗; 去除洗液II，加入1 mL生物素標記的混合抗體，于室溫孵育2 h; 抽去洗液II，加入2 mL 5 000倍稀釋的熒光劑CW800標記的鏈霉親和素，室溫避光振蕩孵育2 h; 熒光掃描(Licor-Odyssey)獲取圖像(每組設3個重復，每組實驗重復3次)。

1.2.3 MCP2處理細胞 將食管癌Eca109細胞和KYSE150細胞接種于6孔板，細胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入MCP2(50 ng/mL)培養(yǎng)48 h，作為MCP2處理組。加PBS代替MCP2作為未處理組(每組設3個重復，每組實驗重復3次)。

1.2.4 細胞劃痕實驗 細胞接種于6孔板，恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用10 μL無菌槍頭在6孔板底部輕劃一條力度和角度一致、粗細均勻的直線(每組設3個重復，每組實驗重復3次)。分別于0、24、48 h在倒置相差顯微鏡下觀察同一視野劃痕的寬度并拍照。

1.2.5 細胞侵襲實驗 配制基質(zhì)膠，將配制的基質(zhì)膠加入到Transwell小室的上室面，置于細胞培養(yǎng)箱中過夜使其充分干燥。Transwell小室下室加入500 μL含10%FBS的1640培養(yǎng)基作為趨化劑，細胞用無血清培養(yǎng)基混勻后加入上室面(5×104/孔)，置于恒溫細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后 ，用棉簽輕輕擦去上室面未穿過膜的細胞，4%多聚甲醛固定，PBS清洗，結晶紫染色30 min后再用PBS清洗，顯微鏡下觀察，每個樣本隨機選取4個視野，計數(shù)每個視野染色細胞的數(shù)量，即穿膜細胞數(shù)，取平均值(每組設3個重復，每組實驗重復3次)。

2 結果

2.1抗體芯片篩查細胞因子用抗體芯片篩查共培養(yǎng)組與非共培養(yǎng)組細胞培養(yǎng)上清中差異表達的細胞因子(圖1a)。結果顯示，共培養(yǎng)組培養(yǎng)上清中MCP2表達增加，與非共培養(yǎng)組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05, 圖1b、1c)。

a： 抗體芯片篩查培養(yǎng)上清中差異表達的細胞因子 b、c： Eca109細胞和KYSE-150細胞與M2TAMs共培養(yǎng)后MCP2的表達明顯增加

(注：與非共培養(yǎng)組比較，*P<0.05，**P<0.01)

圖1抗體芯片篩查細胞因子

2.2MCP2對細胞遷移能力的影響MCP2作用48 h后細胞劃痕愈合能力明顯增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05, 圖2a、b)。

從理論上來講，西方國家由工業(yè)社會步入到后工業(yè)社會的時代背景以及工業(yè)社會產(chǎn)生的諸多生態(tài)弊病催生了可持續(xù)發(fā)展理論和綠色發(fā)展理念，其成為發(fā)展綠色礦業(yè)的理論來源。

2.3MCP2對細胞侵襲能力的影響與對照組比較，MCP2處理組的穿膜細胞數(shù)明顯增加(圖2c)，經(jīng)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001) (圖2d)，表明MCP2處理能增強ESCC細胞的侵襲能力。

3 討論

腫瘤微環(huán)境是調(diào)節(jié)腫瘤生物學行為的重要成分之一，微環(huán)境中的細胞因子、趨化因子等通過與腫瘤細胞的相互作用，促進腫瘤的生長和轉移[10-11]。轉移是惡性腫瘤的生物學特征之一，轉移使腫瘤細胞離開原發(fā)組織器官，通過循環(huán)系統(tǒng)轉移到繼發(fā)組織器官，并形成新的病灶，腫瘤轉移也是導致患者預后不佳的主要因素[12-13]。

腫瘤微環(huán)境是腫瘤細胞存活和進展的基礎，MCP2是微環(huán)境中重要的趨化因子，研究發(fā)現(xiàn)MCP2與多種腫瘤的進展有關，而MCP2在食管癌遷移、侵襲中的作用尚不明確[14-16]。本研究將食管癌細胞與M2 TAMs共培養(yǎng)，篩查共培養(yǎng)后細胞培養(yǎng)上清中差異表達的細胞因子，以研究這些細胞因子對食管癌惡性表型的影響。結果發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)組中Eca109細胞及KYSE-150細胞培養(yǎng)上清中MCP2的表達明顯增加，與非共培養(yǎng)組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。另外，通過細胞功能學實驗來驗證MCP2對食管癌細胞遷移和侵襲能力的影響。細胞劃痕實驗表明，MCP2處理48 h后，Eca109細胞與KYSE-150細胞的遷移能力明顯增加，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Transwell小室細胞侵襲實驗表明，MCP2處理48 h后，Eca109細胞和KYSE-150細胞的侵襲能力均明顯增加，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。本研究結果表明，MCP2可促進ESCC細胞的遷移和侵襲。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個復雜的生物學過程，本研究通過細胞功能學實驗，分別驗證了MCP2在食管癌遷移、侵襲中的重要作用，但MCP2參與食管癌遷移和侵襲的機制尚不明確，此外，MCP2的促瘤作用還需體外動物實驗進一步驗證。

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