巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子在唾液腺腺樣囊性癌中的表達(dá)及臨床意義

胡露露， 龔忠誠(chéng)， 陳青立， 李晨曦， 田忠奇， 尹小朋， 馬 亮， 牛雅琪， 王成剛， 劉 慧

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院頜面腫瘤外科, 烏魯木齊 830054)

早在1853年和1854年，3位法國(guó)學(xué)者(Robin，Lorain，Laboulbene)就分別在兩篇文獻(xiàn)中描述了腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)“圓柱型”表現(xiàn)的病理學(xué)特點(diǎn)，該腫瘤起源于閏管儲(chǔ)備細(xì)胞，是唾液腺上皮源性惡性腫瘤的常見(jiàn)類(lèi)型。雖較其他類(lèi)型頭頸部腫瘤發(fā)病率偏低，但因其惡性程度高、早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)率高、嗜神經(jīng)性生長(zhǎng)、帶瘤存活時(shí)間較長(zhǎng)、治療效果不理想等臨床特點(diǎn)備受關(guān)注。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是Bloom等[1]在1966年發(fā)現(xiàn)，因可抑制巨噬細(xì)胞的遷移而得名。近年的研究表明，MIF除了參與機(jī)體的免疫及炎癥反應(yīng)外，還在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移預(yù)后等方面發(fā)揮了重要的生物學(xué)作用[2-5]，但MIF與腺樣囊性癌的相關(guān)性研究鮮有報(bào)道。

本研究檢測(cè)MIF在唾液腺腺樣囊性癌組織中的免疫組化表達(dá)情況，探討其在唾液腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)發(fā)病中的意義，為SACC的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象收集2005年1月-2016年12月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治并行手術(shù)切除經(jīng)病理診斷確診的腺樣囊性癌病例，共51例。所有患者臨床病理資料及術(shù)后隨訪資料完整，均隨訪至2017年3月31日。男性25例，女性26例，患者年齡31～81歲，中位年齡53.6歲，發(fā)病部位分別為：磨牙后腺(5例，9.80%)，舌下腺(13例，25.49%)，腮腺(16例，31.37%)，頜下腺(3例，5.88%)，鼻腔(1例，1.96%)，腭腺(10例，19.60%)，上頜竇及篩竇(1例，1.96%)，其他部位(2例，3.92%)。選取20例正常腮腺組織(normal salivary gland, NSG)標(biāo)本作為對(duì)照，5例舌鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照。

以2005年世界衛(wèi)生組織(WHO)關(guān)于SACC的組織病理學(xué)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)行腫瘤病理分級(jí)、分類(lèi)。病理分型結(jié)果：51例腺樣囊性癌組織標(biāo)本中，篩孔型21例，管狀型17例，實(shí)體型13例。組織學(xué)分級(jí)結(jié)果：Ⅰ級(jí)：腫瘤中主要為管狀型和(或)篩孔型而無(wú)實(shí)體型的，10例；Ⅱ級(jí)：腫瘤中存在管狀型和(或)篩孔型，實(shí)體型成分≤30%，9例；Ⅲ級(jí)：腫瘤中管狀型和篩孔型較少見(jiàn)，以實(shí)體型為主(實(shí)體部分>30%時(shí)即應(yīng)為實(shí)體型)，32例。

1.2主要試劑兔抗人MIF單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司顯色試劑盒)。

1.3免疫組織化學(xué)染色所有標(biāo)本經(jīng)4%的福爾馬林固定過(guò)夜，梯度乙醇脫水后石蠟包埋并切片，組織切片厚度4 μm。SP二步法行免疫組化染色。兔抗人MIF多克隆抗體一抗工作濃度1∶200，加一抗前，檸檬酸緩沖液( 0.01 mol/ L ，pH 6.0) 高溫高壓修復(fù)抗原1 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。鹽酸乙醇分化，自來(lái)水返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。本實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照組為PBS替代一抗。以舌鱗狀細(xì)胞癌組織切片中的MIF表達(dá)作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4結(jié)果判定由2位病理醫(yī)生閱片并判定，細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色時(shí)定性為MIF陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。判定陽(yáng)性表達(dá)依據(jù)如下：(1)陽(yáng)性細(xì)胞百分比：光鏡(×400)下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野中平均計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5%以內(nèi)，計(jì)0分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)6%～25%，計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，76%～100%計(jì)4分。(2)再根據(jù)陽(yáng)性著色強(qiáng)度依次計(jì)0、1、2、3分(基本不著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分)。每張切片進(jìn)行兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)累計(jì)[6]，1～5分為低表達(dá)，6～7分為高表達(dá)。

1.5隨訪及預(yù)后通過(guò)電話或臨床隨訪患者治療后生存情況，以診斷日期為隨訪開(kāi)始日期，2017年3月31日為末次隨訪截止時(shí)間。對(duì)于可疑復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移患者進(jìn)行進(jìn)一步臨床檢查，以病理結(jié)果及影像學(xué)診斷為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移依據(jù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料使用卡方檢驗(yàn)，等級(jí)資料使用秩和檢驗(yàn)，單因素生存分析使用Kaplan-Meier法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MIF在腺樣囊性癌中的表達(dá)MIF的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：51例唾液腺腺樣囊性癌組織中均檢測(cè)到MIF的陽(yáng)性過(guò)表達(dá)，定位于細(xì)胞胞漿中，偶可見(jiàn)細(xì)胞膜及細(xì)胞核的陽(yáng)性染色，呈中度至強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖1)，MIF表達(dá)平均評(píng)分為(5.490±1.667)分。3種病理學(xué)類(lèi)型(實(shí)體型、篩孔型、管狀型)的MIF表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。與NSG相比較，SACC組織MIF表達(dá)較NSG組織高(P<0.05)(表2)。

A:SACC實(shí)體型(solid)

B:SACC篩孔型(cribriform)

C:SACC管狀型(tubular)

D:NSG正常腮組織

E:SCC舌鱗狀細(xì)胞癌組織

圖1 MIF在唾液腺腺樣囊性癌、正常腮腺組織及舌癌中的表達(dá)情況(×400)

表2 MIF在SACC組織與正常唾液腺組織中的表達(dá)/例

2.2MIF的表達(dá)與腺樣囊性癌臨床病理特征之間的關(guān)系MIF的表達(dá)程度與SACC的病理分型、年齡、性別等無(wú)明顯相關(guān)性。但與SACC TNM臨床分期、腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)及因病死亡等不良轉(zhuǎn)歸有關(guān)(表3)。

2.3生存率分析51例患者平均隨訪時(shí)間為40.59個(gè)月(2～100個(gè)月)，18例患者死于本病，33例患者仍然存活。Kaplan-Meier法分析結(jié)果表明，MIF高表達(dá)患者較MIF表達(dá)相對(duì)較低患者出現(xiàn)因病死亡，或者出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移可能性高(P<0.05),而MIF低表達(dá)組SACC患者的生存率較MIF高表達(dá)組生存率高(圖2、3)。

3 討論

腺樣囊性癌可發(fā)生于任何年齡段(1～90歲)，中年及中年以上患者多見(jiàn)。SACC臨床發(fā)展較為緩慢，病程較長(zhǎng)，腫物無(wú)包膜，浸潤(rùn)性強(qiáng)，極易侵襲其周?chē)纳窠?jīng)并循神經(jīng)擴(kuò)散。SACC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高，甚至早期發(fā)生，常見(jiàn)肺部轉(zhuǎn)移，術(shù)后極易復(fù)發(fā)，治療棘手，目前臨床以手術(shù)為主聯(lián)合放化療作為治療的主要手段?？刂颇[瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是臨床治療中的首要關(guān)鍵問(wèn)題。

表3 MIF的表達(dá)與腺樣囊性癌臨床病理特征/例

各類(lèi)細(xì)胞因子在惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮了復(fù)雜多樣的作用。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明MIF參與并影響了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。MIF基因定位于人22號(hào)染色體長(zhǎng)臂1區(qū)1帶2號(hào)亞帶，相對(duì)分子質(zhì)量為12.5 kDa。在正常的生理情況下，MIF呈組成性表達(dá)，主要來(lái)源于免疫細(xì)胞。不斷有研究發(fā)現(xiàn)MIF在多種惡性腫瘤的細(xì)胞中，如胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、腦膠質(zhì)瘤、皮膚癌、肺癌、惡性黑色素瘤等惡性腫瘤中的表達(dá)明顯升高，且在腫瘤的不同臨床分期及分型中均可檢測(cè)到MIF的差異過(guò)表達(dá)，提示MIF可能與腫瘤的細(xì)胞分化、增殖等過(guò)程有關(guān)。也有研究表明，MIF的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子的分泌，并與腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移潛能及疾病預(yù)后密切相關(guān)。Wilson等[7]發(fā)現(xiàn)外源性MIF濃度增加，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并阻止細(xì)胞凋亡；He等[8]認(rèn)為MIF與胃癌的形成有關(guān)，并考慮作為監(jiān)測(cè)胃癌的特異標(biāo)志性蛋白；Meyersiegler等[9]通過(guò)影響MIF受體CD74的表達(dá)，來(lái)阻滯MIF的信號(hào)傳導(dǎo)通路從而阻止前列腺癌的擴(kuò)散；Xu等[10]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中MIF與IL-8和VEGF過(guò)度表達(dá)呈正相關(guān)，并和乳腺癌的血管再生聯(lián)系密切。

圖2Kaplan-Meier法分析MIF不同表達(dá)情況下SACC患者的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)率

圖3Kaplan-Meier法分析MIF不同表達(dá)情況下SACC患者的生存率

盡管MIF在各類(lèi)疾病中的研究?jī)?nèi)容較為豐富，但我們發(fā)現(xiàn)尚未有明確的MIF與腺樣囊性癌相關(guān)性研究的報(bào)告。MIF在腺樣囊性癌組織中是否有差異表達(dá)？MIF對(duì)腺樣囊性癌的發(fā)生發(fā)展是否發(fā)揮生物學(xué)作用？假使MIF對(duì)腺樣囊性癌的發(fā)生發(fā)展有影響，那么作用機(jī)制又是如何？上述疑問(wèn)是本研究的興趣所在。

本實(shí)驗(yàn)我們利用免疫組化的方法明確MIF在SACC組織中的表達(dá)狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：納入的51例SACC腫瘤組織標(biāo)本中，均檢測(cè)到MIF過(guò)表達(dá)，且主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞漿中，呈中至重度染色；NSG可見(jiàn)MIF的弱陽(yáng)性表達(dá)，但在SACC組織中，MIF的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于NSG， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究結(jié)果顯示，MIF的表達(dá)狀態(tài)和腺樣囊性癌的病理學(xué)分型間無(wú)明顯相關(guān)性，我們推測(cè)此現(xiàn)象可能是由于本研究所納入樣本量有限所致。MIF與腺樣囊性癌患者病理分級(jí)有關(guān)，病理分級(jí)與MIF表達(dá)呈正相關(guān)。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)MIF陽(yáng)性高表達(dá)組的患者總體存活率比MIF陽(yáng)性低表達(dá)組更低。這一結(jié)果提示MIF在腺樣囊性癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮生物學(xué)作用。本研究中納入的51例病例，經(jīng)隨訪后發(fā)現(xiàn)20例出現(xiàn)了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移病例組織中的MIF表達(dá)較非轉(zhuǎn)移病例明顯增高(P<0.05)。本研究結(jié)果提示MIF表達(dá)狀態(tài)與腺樣囊性癌患者預(yù)后有關(guān)，MIF高表達(dá)的患者發(fā)生因病死亡或者發(fā)生復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移大的可能性更大。我們推測(cè)，MIF可促進(jìn)SACC腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力以促進(jìn)腺樣囊性癌的發(fā)展及侵襲，但MIF是通過(guò)何種途徑在腺樣囊性癌發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用尚不明確。有研究指出，MIF可能是上調(diào)了腫瘤細(xì)胞的金屬基質(zhì)蛋白酶的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)，以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力。因此，本研究需進(jìn)一步研究MIF在ACC發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。

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