CD8+CIK細胞表面NKG2D及TCR抗原識別受體的功能分析

王耀玲，劉建華

(上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院婦產科，上海200011)

近年來，隨著免疫卡控點(immune checkpoint)如程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1，PD-1)封阻療法在臨床治療惡性腫瘤取得成功之后，重建或增強抗腫瘤免疫機制的重要性正日益受到關注[1]，其中過繼細胞治療(adaptive cell therapy，ACT)作為國內外廣泛使用的一種免疫治療手段，也迎來了一個發(fā)展新時期。

細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killer cell，CIK細胞)是國內最常用的ACT方式[2]，在多種類型的惡性腫瘤臨床治療中都被證明能夠改善患者生存[3-4]。CIK細胞是經γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)和CD3單克隆抗體(CD3 monocolonal antibody，CD3mAb)激活的一種殺傷性T細胞，其中CD3+CD8+細胞(包括CD56+和CD56-細胞)被認為是CIK細胞中抗癌活性最強的效應細胞亞群。此類CD8+CIK細胞雖然表達多克隆的T細胞受體(T cell receptor，TCR)，但能夠以人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)非限制的方式殺滅癌細胞。這種免疫效應功能被認為是通過NKG2D(即CD314)抗原識別受體來介導的，如主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)-Ⅰ類相關分子(MHC class Ⅰ chain-related molecules，MIC)A+的腫瘤患者多為CIK細胞治療的獲益者[5-6]。也有研究者認為，CD8+CIK細胞更類似經典的細胞毒T細胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)，其抗癌效應取決于CD8+CIK細胞表面TCR與靶細胞表面相應HLA-抗原多肽復合物的特異性結合。顯而易見，闡明CD8+CIK細胞表面TCR和NKG2D受體的功能有助于深化了解此類效應細胞的抗癌機制并為提高其臨床療效提供研究新思路。

本課題通過磁性細胞分選(magnetic-activated cell sorting system，MACS)技術富集了CD8+CIK細胞，表型分析揭示此類CIK細胞亞群同時表達CD3和NKG2D。在此基礎上，以細胞激活表達CD137抗原、分泌IFN-γ和細胞殺傷活性作為評估標志，對CD8+CIK細胞表面上述受體的功能進行了初步分析。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞

K562細胞購自中國科學院上海生科院細胞資源中心，培養(yǎng)基用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的RPMI 1640培養(yǎng)基、100U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素。CIK細胞用GT-T551培養(yǎng)基、1 000U/mL白介素-2(interleukin-2，IL-2)。培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2。

1.1.2試劑

胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，GT-T551培養(yǎng)基(日本Takara公司)，MACS buffer、CD8免疫磁珠(德國Miltenyi公司)，IL-2、抗人CD3單克隆抗體(北京同立海源生物科技有限公司)，IFN-γ(上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司)，抗人NKG2D抗體、CD8-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、CD27-FITC、CD28-藻紅蛋白(P-phycoerythrin，PE)、HLA-ABC-FITC、MICA/B-PE(美國BD公司)，F(xiàn)ITC-羊抗鼠IgG(美國Santa Cruz公司)，CD3-別藻藍蛋白(allophycocyanin，APC)、CD4-PE(MACS公司)，NKG2D-PE(Biolegend公司)，CD137-PE(eBioscience公司)。

1.1.3儀器

流式細胞儀：Accuri C6個人型流式細胞儀-ND，美國BD Biosciences公司；磁珠分選儀：磁珠分選起始套裝，德國Miltenyi公司；離心機：L-550型，長沙湘儀離心機儀器有限公司；CO2細胞培養(yǎng)箱：3517-2型，美國SHELLAB公司；倒置生物顯微鏡：XDS-1B，重慶光電儀器有限公司；生物安全柜：BHC-1300IIA2，阿爾泰實驗室設備(北京)有限公司。

1.2方法

1.2.1分離外周血多個核細胞

本研究經上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會批準，與志愿者簽訂書面知情同意書。腫瘤志愿者系本院收治并經病理檢查確診的9位卵巢癌患者。采集20mL外周靜脈血，乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗凝。聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)密度梯度離心法制備分離外周血多個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。

1.2.2 CIK細胞制備和培養(yǎng)

調整PBMC至1×106/mL，加入1 000U/mLIFN-γ，于含5% FBS的GT-T551培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天。次日加入30ng/mLCD3抗體及1 000IU/mL IL-2刺激CIK細胞增殖。適當補充5% FBSGT-T551培養(yǎng)基和1 000U/mL IL-2，連續(xù)培養(yǎng)1周。

1.2.3 CD8+CIK細胞的磁性細胞分選(MACS)及培養(yǎng)

收集培養(yǎng)1周的CIK細胞，計數(shù)后400g離心10min，棄上清。細胞沉淀重懸于500mL MACS buffer中，加入20μLCD8免疫磁珠標記T細胞。室溫放置30min后，加入5mL磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)，400g離心10min，棄上清。細胞沉淀重懸于500mL PBS中，按照生產商提供的操作手冊，采用LS分離柱洗脫CD8-細胞，經3mL PBS洗滌3次后，加入5mLPBS，收集CD8+CIK細胞。將分選的CD8+CIK細胞經400g 離心5min，棄上清。用5% FBS-GT-T551培養(yǎng)基調整至1×106/mL。加入1 000U/mL IL-2后置于T25瓶中培養(yǎng)。間隔1～2天取樣20μL計數(shù)活細胞后，調整細胞密度至5×105/mL并補充1 000U/mLIL-2，連續(xù)培養(yǎng)2周。

1.2.4 CD8+CIK細胞免疫表型檢測

檢測CD3、CD4、CD8、NKG2D、CD27、CD28的表達：5×106CD8+CIK細胞中加入PBS至3mL。400g×5min 離心，棄上清。加入500μL MACS buffer。流式細胞術(flow cytometry，F(xiàn)CM)管(6管)中加入100μL/管細胞及抗體。4℃避光溫育30min。加入3mL/管PBS，400g×5min離心，棄上清。加入500μL/管PBS，流式細胞檢測陽性細胞。

1.2.5激活CD3及NKG2D抗原受體誘導CD137表達

2mL PBS中加入2μL CD3抗體(1mg/mL)，終濃度=1μg/mL，24孔板(3孔實驗組和3孔對照組)中分別加入500μL/孔CD3稀釋抗體和500μL/孔PBS，37 ℃溫育4h。收集CD8+CIK細胞，計數(shù)，5%FBS GT-T551培養(yǎng)基調整至2×106/mL，吸凈24孔板中上清，每孔加入500μL CD8+CIK細胞(1×106/孔)，培養(yǎng)3天。間隔24h，分別收集1孔實驗組及對照組細胞，置于FCM管中，加入2mL/管PBS，400g×5min，棄上清。加入200μL/管MACS buffer，均分2管(100μL/管)，熒光抗體標記，4 ℃避光溫育30min，加入3mL/管 PBS，400g×5min 離心，棄上清，加入500μL/管PBS，檢測CD8+CD137+細胞百分比。

24孔板(6孔)中A、B孔加入500μL/孔 PBS，C、D孔CD3抗體包被(1μg/mL)，E、F孔NKG2D抗體包被(10μg/mL)，操作同上，A、C、E管不加抗體，B、D、E管加入50μL/管葉綠素蛋白(peridininchorophyll protein，PerCP)-CD8抗體和5μL/管PE-CD137抗體。檢測CD8+CD137+細胞百分比。

1.2.6激活CD3及NKG2D受體誘導IFN-γ表達

24孔板(A～F共6孔)如上進行抗體包被、CIK細胞制備。加入500μL/孔 CD8+CIK細胞(1×106/孔)，37℃溫育1h。配置60μg/mL布雷菲德菌素A(Brefeldin A，BFA)溶液，加入100μL/孔(終濃度=10μg/mL)，37℃溫育過夜。FCM檢測CD8+IFN-γ+細胞。

1.2.7靶細胞K562細胞表型檢測

K562細胞重懸于MACS buffer中。FCM管內加入100μL/管細胞(6×105/管)。實驗組加入20μL/管MICA/B抗體，對照組不加抗體。4℃避光溫育30min。加入3mL/管PBS離心洗滌1次。細胞重懸于100μL MACS buffer中。加入5μL/管FITC-羊抗鼠IgG。4℃避光溫育30min。加入3mL/管PBS離心洗滌1次。細胞重懸于500μL PBS中，上機檢測。FCM管內加入100μL/管K562細胞(6×105/管)。實驗組加入5μL/管FITC-HLA-ABC抗體，對照管不加抗體。4℃避光溫育30min。加入3mL PBS，400g離心5min，棄上清。細胞沉淀重懸于500μLPBS。以對照組細胞為基準，流式細胞檢測實驗組中HLA+細胞比例。

1.2.8 NKG2D的抗原識別及細胞殺傷活性檢測

收集K562細胞，計數(shù)。15mL離心管中加入4×106細胞，加入PBS至10mL。400g×10min離心，棄上清。加入2mL PBS及2μL羧基熒光素雙乙酸鹽-琥珀酰亞胺酯(carboxyfluoresceindiacetate，succinimidyl ester，CFSE)，室溫放置5min。加入2mLFBS，搖勻，終止CFSE蛋白標記反應。加入6mLPBS，400g×10min離心，棄上清。加入1mL 5%FBS GT-T551，計數(shù)，調整至2×106/mL。FCM管(2管)中加入500μLK562細胞，分為對照管和實驗管。實驗管中加入20μLNKG2D-Fc重組蛋白。室溫放置30min。收集CD8+CIK細胞，計數(shù)。取4×107細胞，400g×10min離心，棄上清。加入1mL 5%FBSGT-T551，調整至4×107/mL。FCM管(7管)A～D管加入對照組K562細胞，E～G管加入實驗組K562細胞，C、D、F、G管另加CD8+CIK細胞，C、F管E:T(效靶比)=20:1，D、G管E:T=10:1。400g×5min離心。37℃溫育4h。B-G管進行PI染色。室溫放置15min。加入3mL/管PBS，400g×5min離心，棄上清。加入400μL/管PBS。FCM檢測。以B管為對照組，C、D管是實驗組，再以E管為對照組，F(xiàn)、G管為實驗組，特異性殺傷%=[(實驗組PI+%-對照組PI+%)/(100%-對照組PI+%)]×100%。

2結果

2.1 CD8+CIK細胞表達NKG2D受體

9例卵巢癌志愿者血樣用于制備CD8+CIK細胞。實驗采用MACS技術從培養(yǎng)2周左右的CIK細胞中獲得了CD8+細胞亞群，平均得率為48.4%，平均細胞數(shù)為48×106。流式細胞檢測顯示，分選后的CD8+CIK細胞中CD3+CD8+細胞所占百分比平均為98.5%，CD8+NKG2D+細胞平均達到97.0%,見表1。圖1列舉了CD8+CIK細胞制備過程中的代表性檢測結果(D3供體)，如圖1A所示，PBMC中CD8+細胞占24.2%，該細胞群中NKG2D陽性率為16.3%。CIK培養(yǎng)后CD8+細胞比例增至88.1%，這些CD8+CIK細胞均表達NKG2D，但其中仍含10%左右的CD8-細胞見圖1B。MACS分選去除CD8-細胞后獲得了高度均質性的CD8+CIK細胞，其中CD3+CD8+細胞和CD8+NKG2D+細胞分別為99.2%和98.3%，見圖1C。

表1 CD8+CIK細胞的純度與表型(%)

注：A組為PBMC免疫表型特征，B組為CIK細胞分選前表型，C組為CD8+CIK表型。

圖1 CD8+CIK細胞表達NKG2D

Fig.1 Expression of NKG2D on surface of CD8+CIK cells

2.2激活CD3及NKG2D受體誘導CD137表達

將CD3抗體包被在培養(yǎng)板中，加入CD8+CIK細胞培養(yǎng)24h、48h和72h后檢測CD137表達作為評估細胞激活的標志。圖2結果顯示，CD3抗體刺激CD3-TCR抗原受體復合物24h即已明顯激活CD8+CIK細胞，CD137陽性率可以達到83.1%，但延長培養(yǎng)時間并不能進一步提高CD137+細胞比例。

實驗選擇培養(yǎng)24h作為觀察點評估了NKG2D抗體的激活功能。結果顯示，對照組(無抗體包被)細胞中檢測不到CD137表達(見圖3A、B)，CD3抗體組中CD137陽性率為88.8%(見圖3C、D)，而NKG2D抗體組也未檢測到CD137(見圖3E、F)，提示在CD8+CIK細胞中，NKG2D抗原受體可能并不提供有效的激活信號。

注：A、B、C分別為CD3抗體包被在24h、48h和72h后CD8和CD137的表達。

圖2激活CD3誘導CD137表達

Fig.2 Expression of CD137 after activating CD3

注：A、B為對照組，C、D為CD3抗體包被組，E、F為NKG2D抗體包被組；A、C、E未加熒光抗體作為對照。

圖3激活CD3及NKG2D誘導CD137表達

Fig.3 Expression of CD137 after activating CD3 and NKG2D

2.3激活CD3及NKG2D受體誘導IFN-γ表達

CD8+T細胞激活后除了表達CD137外，還能分泌IFN-γ。據此檢測了NKG2D抗體對CD8+CIK細胞分泌IFN-γ的影響。實驗采用細胞內細胞因子染色(intracellular cytokine staining)技術進行檢測，如圖4所示，CD3抗體刺激后24h，約50%的CD8+CIK細胞呈IFN-γ染色陽性(見圖4B、C)，而NKG2D抗體刺激后，IFN-γ陽性率(4.8%和5.6%)高于對照組(2.9%)，但明顯低于CD3抗體，說明抗體刺激NKG2D受體能夠輕度誘導CD8+CIK細胞表達IFN-γ。

注：A為對照組，B、C為CD3抗體包被組，D、E為NKG2D抗體包被組。

圖4激活CD3及NKG2D受體誘導IFN-γ表達

Fig.4 Inducing expression of IFN-γ after activating CD3 and NKG2D

2.4 NKG2D配體誘導IFN-γ表達

NKG2D屬于C型凝集素樣表面受體，其識別的主要配體是靶細胞表面的HLA-Ⅰ類抗原相關分子即MICA和MICB。據此我們評估了此類NKG2D配體對CD8+CIK細胞IFN-γ分泌能力的影響。實驗選擇K562白血病細胞作為刺激細胞，圖5結果顯示，K562細胞表面不表達HLA-Ⅰ類分子因而不會激活CD8+CIK細胞表面CD3-TCR受體，但MICA/B抗原陽性率為99.7%，所以K562細胞能夠被CD8+CIK細胞表面的NKG2D受體識別。

圖6結果顯示，CD8+CIK細胞經CD3抗體刺激24h后IFN-γ檢測陽性率為41.9%，但與K562細胞按1:1比例共培養(yǎng)后陽性率僅為0.5%。由此說明，NKG2D配體也不能明顯刺激CD8+CIK細胞分泌IFN-γ。

圖5 K562細胞表面HLA-ABC及MICA/B抗原表達

Fig.5 Expressions of HLA-ABC and MICA/B antibodies on the surface of K562 cells

注：A、B為對照，C、D為CD3抗體包被組，E、F為K562細胞共培養(yǎng)組。

圖6 K562細胞共培養(yǎng)誘導IFN-γ表達

Fig.6 Expression of IFN-γ induced by K562 cells co-culture

2.5 CD8+CIK細胞的HLA非限制性殺傷活性

CIK細胞具有HLA限制及非限制性的抗癌效應，其中前者通過TCR識別靶細胞表面與HLA分子結合的抗原表位(epitopes)，而后者被認為主要通過NKG2D受體的MICA/B抗原識別機制。CD8+細胞是CIK細胞中的主要效應細胞，此類CIK細胞激活后有可能通過NKG2D-MICA/B相互作用識別靶細胞從而發(fā)揮免疫攻擊效應。

實驗采用CD3抗體激活的CD8+CIK細胞作為效應細胞，K562細胞作為靶細胞，并用NKG2D-Fc重組蛋白與靶細胞預溫育的方式封阻MICA/B，觀察效應細胞的殺傷活性。圖7結果顯示，當效靶比為20:1時，CD8+CIK細胞對K562細胞的殺傷活性為16.89%，封阻MICA/B后殺傷活性降至13.44%。但效靶比為10:1時，封阻MICA/B對CD8+CIK細胞的殺傷活性沒有明顯影響。實驗結果提示，CD8+CIK細胞具有HLA非限制性的抗癌功能，但NKG2D受體在其抗原識別過程中的作用比較有限。

圖7 NKG2D-Fc重組蛋白封阻NKG2D后CD3包被的CD8+CIK細胞的殺傷活性

Fig.7 Cytotoxicity of CD3 antigen-coated CD8+CIK cells after NKG2D blocked by NKG2D-Fc recombinant protein

3討論

3.1 TCR和NKG2D在CD8+CIK細胞激活和腫瘤殺傷兩方面的作用

CIK細胞是一類主要由IFN-γ和CD3抗體多克隆激活之后能活躍增殖并且具有抗癌功能的殺傷T細胞，是如今過繼性腫瘤細胞免疫治療中臨床應用最多的效應細胞。資料表明，CIK細胞治療聯(lián)合化療等其他治療手段可以改善惡性腫瘤患者的預后[7]。然而，CIK細胞制劑存在著明顯的個體差異，同時其殺傷活性通常低于抗原特異性激活的細胞毒T淋巴細胞(CTL)，抗原識別機制不同是造成這種抗癌能力有所差異的原因之一；此外，腫瘤細胞表面的抗原表達亦存在明顯的個體差異，這就為研究和利用CIK細胞不同的腫瘤抗原識別和殺傷機制提出了要求。本研究通過實驗和總結，對TCR和NKG2D在CD8+CIK細胞的激活和對腫瘤細胞的殺傷兩個方面的功能進行初步分析。

CD137分子與其配體結合之后為T細胞的活化提供第二信號，CD137主要在活化的T細胞表面表達[8]，因此可將CD137分子作為T細胞活化的標志。CD8+T細胞激活后除了表達CD137外，還能分泌IFN-γ。本實驗首先分別利用CD3抗體和NKG2D抗體來刺激TCR和NKG2D受體，以CD137的表達作為激活標志，結果證明刺激TCR可以活化CD8+CIK細胞，但刺激NKG2D抗原識別受體卻不能激活CD8+CIK細胞。而采用NKG2D抗體或配體(K562細胞提供)刺激NKG2D受體僅能輕度誘導CD8+CIK細胞表達IFN-γ。因此活化CD8+CIK細胞的主要信號在TCR-CD3復合體上而非NKG2D上。

CD3抗體刺激T淋巴細胞活化(即包被)的原理是高密度、固相結合的CD3抗體能引起T細胞上TCR-CD3復合體的交聯(lián)而產生活化信號，來刺激T細胞的活化和增殖。高濃度CD3單抗包被可以達到迅速刺激T細胞活化與增殖的目的，但活化的同時誘導的凋亡作用(activation induced apoptosis，AICD)也很明顯[9]。根據前期實驗并參考文獻，本研究選擇1μg/mL濃度的CD3單抗進行包被。

K562細胞表型檢測結果與資料[10]反映的HLA-Ⅰ類分子(-)、MICA/B(+)表型一致，所以K562細胞不能被TCR識別、只能被NKG2D識別，即TCR與K562細胞無法相互作用，CD8+CIK細胞對K562細胞的殺傷效應只能通過HLA非限制性的途徑發(fā)揮。

實驗在刺激TCR使CD8+CIK細胞活化的基礎上封阻NKG2D與MICA/B的相互作用后，發(fā)現(xiàn)CD8+CIK細胞的殺傷活性部分受到抑制?？梢奀D8+CIK細胞能以HLA非限制的方式殺傷靶細胞，這種殺傷效應可由NKG2D介導，但其作用比較有限。

由此總結，TCR能夠提供活化信號激活CD8+CIK細胞；而NKG2D不能提供有效的激活信號，它只能與其配體相互作用從而介導HLA非限制的抗癌功能，故當靶細胞表面沒有TCR可識別的抗原表達或靶抗原未能與之結合(靶細胞表面HLA陰性、HLA不相合)時，可由NKG2D識別相應靶抗原即NKG2D配體，相當于在效應細胞與靶細胞之間架橋使二者結合起來，并轉導信號至CIK細胞內部，產生殺傷效應。然而，NKG2D受體在其抗原識別過程中的作用比較有限，CIK細胞主要通過TCR進行抗原識別，啟動免疫應答。

一方面，CD8+CIK細胞表面表達多克隆的TCR，能夠識別結合靶細胞表面HLA-抗原多肽復合物產生活化信號，經過CD3分子將刺激信號轉導至T細胞內部，而激活CD8+CIK細胞，啟動免疫應答。另一方面，CD8+CIK細胞上的NKG2D受體能以HLA非限制的方式識別腫瘤細胞表面的NKG2D配體，即MICA、MICB和UL-16結合蛋白(UL-16 binding proteins，ULBPs)，其抗癌機制是NKG2D-NKG2DL相互作用后，招募銜接蛋白(adaptor protein，DAP)10而激活下游的Grb2-vav-SOS1及PI3k-AKT信號通路，通過脫顆粒效應即促使CD8+CIK細胞釋放穿孔素和顆粒酶，引起靶細胞凋亡。據此可知，CD8+CIK細胞兼有TCR和NKG2D抗原識別受體的表達，并能夠通過此二者分別以HLA限制及非限制的方式發(fā)揮免疫效應功能，以前者的作用為主。

3.2探究CD8+CIK細胞抗癌特別是卵巢癌的意義

所有NKG2D配體分子在正常成年組織細胞表面均很少表達，但可表達于許多腫瘤細胞表面?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在人體腫瘤中，NKG2D配體在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、腎癌、前列腺癌、膠質瘤、黑色素瘤和白血病中皆有明顯表達。而CD8+CIK細胞均表達NKG2D受體。本研究顯示CD8+CIK細胞上NKG2D誘導的免疫效應相對有限，NKG2D介導的抗原識別和殺傷效應仍有待進一步探究利用。

那么，CD8+CIK細胞治療卵巢癌的價值何在？①卵巢癌作為一種高度惡性的女性生殖系統(tǒng)腫瘤，死亡率居于婦科惡性腫瘤之首，多種治療方法效果都不盡如人意，需要探索更加有效的輔助治療方式，資料表明，CIK細胞治療聯(lián)合化療等其他治療手段可以改善惡性腫瘤患者的預后；②正常卵巢不表達NKG2D配體，但NKG2D配體不同程度地廣泛表達于卵巢癌，McGilvray等[11]研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)卵巢腫瘤以中至高強度表達一種或多種配體，故可將其作為治療靶點；③易發(fā)生腹腔轉移是卵巢癌的生物學特征之一和嚴重威脅患者生存的風險因子，利用CD8+CIK細胞控制卵巢癌腹腔轉移的優(yōu)勢在于腹腔作為一個閉合空間，輸注的免疫細胞更容易發(fā)揮抗癌效應，且以腹水的產生和細胞學檢測為指標，臨床觀察時間較短、療效評估也更加客觀方便；④從免疫學的角度，轉移的卵巢癌細胞上免疫相關分子的表達與預后密切相關，研究還發(fā)現(xiàn)ULBP2和視黃酸早轉錄物1E(retinoic acid early transcript 1E，RAET1E)陽性表達者預后差[11]，故將分選的CD8+CIK細胞(均表達NKG2D)注入封閉的腹腔內，靶向殺滅此類配體陽性的細胞將能改善患者的生存；⑤卵巢癌與其他惡性腫瘤一樣具有異質性，加之不同患者癌細胞表面的各種癌抗原和HLA-Ⅰ類分子等表型特征存在明顯的個體差異，故CIK細胞通過不同的抗原識別機制和免疫殺傷效應發(fā)揮抗腫瘤免疫作用的效果亦表現(xiàn)出很大的差別，這就需要更加個體化、針對性地輸注患者所需的免疫細胞進行治療，若條件允許，必要時還可對患者的癌細胞進行免疫表型檢測。因此靶向腫瘤細胞的精準免疫治療在卵巢癌上具有很大的臨床應用價值。

CD8+CIK細胞上兩類抗原識別受體TCR和NKG2D的抗原識別機制和介導免疫殺傷效應的作用機理，有待進一步研究，從而為提高這種過繼性細胞免疫治療對包括卵巢癌在內惡性腫瘤的臨床療效提供理論依據，拓展更大的、潛在的臨床應用前景。

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