富氫鹽水對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制研究

涂盛 邵安文 盛吉芳

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）主要由動(dòng)脈瘤破裂引起，約占腦卒中的9%[1]。長期以來，腦血管痙攣被認(rèn)為是SAH預(yù)后不良的重要危險(xiǎn)因素，許多臨床及動(dòng)物研究期望通過抑制血管痙攣從而阻止繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生[2-3]。后來，實(shí)驗(yàn)研究表明腦血管痙攣與SAH預(yù)后之間未見顯著相關(guān)性[4]。學(xué)者們猜測(cè)可能存在其他機(jī)制參與SAH后的病理進(jìn)程。近年來實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，早期腦損傷（即在SAH 72h內(nèi)發(fā)生急性腦損傷）的病理、生理過程對(duì)SAH預(yù)后的影響較大，其中神經(jīng)細(xì)胞凋亡是關(guān)鍵因素之一[5]。相關(guān)研究表明減少細(xì)胞凋亡可明顯改善神經(jīng)功能，提示這可能是治療SAH的一個(gè)重要作用靶點(diǎn)[6-8]。氧化應(yīng)激在SAH后早期腦損傷引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用，伴隨而來的是活性氧（ROS）水平升高和抗氧化系統(tǒng)受損[9-10]。各項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明，抗氧化治療可以有效減輕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及臨床患者的神經(jīng)功能損傷，部分原因歸功于上述治療的抗凋亡效應(yīng)[6，8，11]。因此，探索潛在的抗氧化藥物可能是未來SAH治療的重要方向。氫氣是一種安全、高效的抗氧化劑，能夠有選擇性地清除最強(qiáng)效的ROS（ONOO-和·OH）。關(guān)于氫氣的神經(jīng)保護(hù)作用，目前已在神經(jīng)退行性疾病、腦缺血、腦出血、創(chuàng)傷性腦損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中進(jìn)行研究[12-13]。本團(tuán)隊(duì)前期研究也證實(shí)氫氣對(duì)SAH后遲發(fā)性血管痙攣和早期腦損傷具有改善作用[14-16]；其他研究者也證實(shí)，氫氣可通過抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)和腦水腫從而改善早期腦損傷，最終減輕神經(jīng)功能損傷[17-19]。JAK家族的細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶傳統(tǒng)上認(rèn)為與細(xì)胞因子受體結(jié)合，有4個(gè)家族成員 （JAK1、JAK2、JAK3、TYK2）[20]。一旦激活，JAK酪氨酸磷酸化并激活其他信號(hào)分子，包括轉(zhuǎn)錄因子（STAT）[21]。因此，JAK是細(xì)胞表面受體與導(dǎo)致細(xì)胞生長的核轉(zhuǎn)錄事件之間的重要聯(lián)系。相關(guān)研究表明，SAH發(fā)生后基底動(dòng)脈壁中JAK2水平明顯增加[22-23]。Osuka等[24]提出SAH能引起腦脊液促炎因子IL-6的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)基底動(dòng)脈中的JAK1磷酸化。然而，目前尚無研究探討JAK2激活在SAH后早期腦損傷中的作用。因此，筆者對(duì)SAH大鼠腹腔注射富氫鹽水，評(píng)估JAK2活化在SAH后的改變，以明確其神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：將69只成年雄性SD大鼠（購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心，體重280～320g）隨機(jī)分為假手術(shù)組18只、0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）組26只、富氫鹽水組25只，由于造模后死亡或SAH評(píng)分＜8分剔除大鼠15只，最終假手術(shù)組、生理鹽水組、富氫鹽水組各18只。實(shí)驗(yàn)前用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，生長環(huán)境的溫度維持在25℃左右。（2）富氫鹽水：在高壓（0.4MPa）環(huán)境下，將氫氣溶解于0.9%氯化鈉溶液中，使用一種產(chǎn)氫裝置（中國上海第二軍事醫(yī)科大學(xué)提供）達(dá)到過飽和的水平。富氫鹽水每周制備1次，以確保濃度＞0.6mmol/L[15]。

1.2 造模及給藥方法 （1）本實(shí)驗(yàn)造模方法參考相關(guān)文獻(xiàn)并作適當(dāng)修改，通過血管內(nèi)穿刺法建立SAH模型[7]。生理鹽水組、富氫鹽水組大鼠按400mg/kg經(jīng)腹腔內(nèi)注射水合氯醛進(jìn)行麻醉，在實(shí)驗(yàn)中根據(jù)情況適時(shí)注射水合氯醛維持麻醉。使用加熱墊使大鼠體溫維持在37℃左右。經(jīng)大鼠頸部皮膚中線切口，暴露左頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎并離斷左頸外動(dòng)脈，用血管剪剪開約3mm小口，使用4-0尼龍線插入小口并刺破大腦前動(dòng)脈與大腦中動(dòng)脈的分叉，從而完成SAH模型的制作。假手術(shù)組大鼠除了最后不刺破分叉外，其余過程與上述相同。（2）給藥方法：假手術(shù)組不給藥；富氫鹽水組造模后立即按5ml/kg經(jīng)腹腔注射富氫鹽水，8h后再注射1次[15-16]；生理鹽水組也在造模后立即腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液，8h后再注射1次。

1.3 評(píng)估指標(biāo) 造模后24h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，然后處死所有大鼠，進(jìn)行SAH評(píng)分。每組6只大鼠進(jìn)行腦組織水含量測(cè)定；每組6只大鼠用多聚甲醛水溶液灌注后，取腦組織進(jìn)行TUNEL染色；每組6只大鼠大腦取出后冷凍在液氮中，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。（1）神經(jīng)功能評(píng)分：造模后24h，由2位不知曉動(dòng)物分組的研究人員在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠進(jìn)行改良的Garcia評(píng)分[25]，評(píng)分內(nèi)容包括自發(fā)性活動(dòng)、四肢運(yùn)動(dòng)對(duì)稱、前肢的伸展情況、金屬網(wǎng)狀壁上攀登、雙側(cè)軀干的觸碰反應(yīng)和觸須反應(yīng)等6項(xiàng)，其中前 3 項(xiàng) 0～3 分/項(xiàng)，后 3 項(xiàng) 1～3 分/項(xiàng)，評(píng)分范圍3～18分。評(píng)分越低表示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。（2）SAH評(píng)分：根據(jù)Sugawara等[26]提出的方法進(jìn)行SAH評(píng)分，將大腦基底分為6個(gè)部分，按每個(gè)部分的出血量進(jìn)行1～3分的評(píng)分：無出血為0分，極少量出血為1分，中等量的血凝塊且可分辨出血管為2分，大量出血且血凝塊覆蓋腦血管為3分。6個(gè)部分的分?jǐn)?shù)相加，評(píng)分范圍0～18分。（3）腦組織含水量：將全腦分為左大腦半球、右大腦半球、小腦、腦干等4個(gè)部分，用電子分析天平（精確到0.lmg）測(cè)量腦組織濕重，放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（100℃）烘烤72h至恒重，測(cè)干重（兩次稱重誤差＜0.1mg），用干濕重法計(jì)算腦組織含水量，腦組織含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100.00%。（4）ROS、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平：取新鮮腦組織裂解、勻漿、離心、蛋白定量，ROS水平的檢測(cè)選用目前最常用的細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)探針DCF-DA，混合液的熒光強(qiáng)度由熒光酶標(biāo)儀來測(cè)定，最終ROS測(cè)定結(jié)果以熒光強(qiáng)度/毫克蛋白（mg prot）表示。按操作說明書檢測(cè) MDA（nmol/mg prot）、SOD（U/mg prot）、GSH-Px（U/mg prot）水平，與 ROS 檢測(cè)方法類似。（5）凋亡神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)：采用TUNEL染色法。將冷凍切片加入0.3%Trixon-100進(jìn)行通透處理，用5%羊血清進(jìn)行封閉，加入TUNEL反應(yīng)混合液（TdT+熒光素標(biāo)記的dUTP液），加蓋玻片在暗濕盒中反應(yīng)。隨后分別加入converter-POD和DAB底物，封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察TUNEL染色陽性的細(xì)胞數(shù)，即凋亡神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)。（6） 磷酸化的 JAK2（pJAK2）、總 JAK2（tJAK2）、Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)水平：采用 Western blot法。在預(yù)定時(shí)間處死大鼠，取穿刺側(cè)大腦半球腦組織，提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度，上樣電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗、二抗，曝光顯影。本實(shí)驗(yàn)用于測(cè)定pJAK2、tJAK2、Bax和Caspase-3的蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。3組大鼠死亡率比較采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠死亡率、神經(jīng)功能評(píng)分、SAH評(píng)分及腦組織含水量比較 3組大鼠死亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，生理鹽水組神經(jīng)功能評(píng)分降低（P＜0.05）；與生理鹽水組比較，富氫鹽水組明顯升高（P＜0.05）。SAH發(fā)生24h后，蛛網(wǎng)膜下腔血凝塊主要分布在Willis環(huán)和腦干腹側(cè)周圍；3組大鼠SAH評(píng)分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，生理鹽水組腦組織含水量明顯升高（P＜0.05）；與生理鹽水組比較，富氫鹽水組明顯降低（P＜0.05），見圖 1。

圖1 3組大鼠死亡率、神經(jīng)功能評(píng)分、SAH評(píng)分及腦組織含水量比較（與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與生理鹽水組比較，△P＜0.05）

2.2 3組大鼠ROS、MDA、SOD、GSH-Px水平比較 與假手術(shù)組比較，生理鹽水組ROS、MDA水平均明顯升高（均P＜0.05），SOD、GSH-Px水平均明顯下降（均P＜0.05）。與生理鹽水組比較，富氫鹽水組ROS、MDA水平均明顯下調(diào)（均P＜0.05），SOD、GSH-Px水平均明顯上調(diào)（均P＜0.05），見圖2。

圖2 3組大鼠 ROS、MDA、SOD、GSH-Px水平比較（與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與生理鹽水組比較，△P＜0.05）

2.3 3組大鼠凋亡神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 假手術(shù)組幾乎沒有發(fā)現(xiàn)凋亡神經(jīng)細(xì)胞。與假手術(shù)組比較，生理鹽水組凋亡神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增加。與生理鹽水組比較，富氫鹽水組凋亡神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯減少，見圖3（插頁）。

2.4 3 組大鼠 pJAK2、tJAK2、Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較 3組大鼠tJAK2蛋白表達(dá)水平相近；與假手術(shù)組比較，生理鹽水組、富氫鹽水組pJAK2/tJAK2均較高（P＜0.05）；與生理鹽水組比較，富氫鹽水組pJAK2/tJAK2降低（P＜0.05），這表明富氫鹽水可以抑制JAK2的激活及磷酸化。與假手術(shù)組比較，生理鹽水組、富氫鹽水組Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平均較高（P＜0.05）；與生理鹽水組比較，富氫鹽水組Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05），見圖 4。

3 討論

本研究主要探討富氫鹽水對(duì)大鼠SAH后神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。首先，使用血管內(nèi)穿刺法建立的SAH模型會(huì)引起細(xì)胞（尤其是神經(jīng)元）凋亡，給予富氫鹽水治療后可以減少凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量，減輕神經(jīng)損傷。此外，注射富氫鹽水會(huì)引起SOD、GSH-Px水平升高，ROS、MDA水平下降；還能抑制JAK2的激活，降低Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平。

既往研究表明，SAH引起的線粒體功能障礙將會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，在早期腦損傷中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[27-28]。而氧化應(yīng)激通常與高反應(yīng)性自由基相關(guān)，包括ROS和活性氮（RNS），·OH和ONOO-是其中活性最強(qiáng)的[12]。相關(guān)研究證明，硝基酪氨酸、MDA和8-OHG分別作為蛋白質(zhì)、液體和DNA氧化的主要標(biāo)記物，其含量會(huì)在SAH發(fā)生后明顯增加[17-18，29]。以往研究表明，SAH后氧化應(yīng)激的發(fā)生主要是由蛛網(wǎng)膜下腔血塊紅細(xì)胞中的氧合Hb引起的[30]；且氧化應(yīng)激多發(fā)生在神經(jīng)元中，與SAH后神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[31]。因此，抑制氧化應(yīng)激誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡是SAH的重要治療策略[32-34]。作為一種新型抗氧化劑，氫氣可以有選擇性地清除·OH和ONOO-[12]，可在動(dòng)物和臨床研究中被用于各種疾病的治療。近年來，氫氣被用于包括SAH在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療研究。既往研究表明使用氫氣治療SAH的效果良好。而本研究結(jié)果亦表明富氫鹽水減少了神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善了神經(jīng)功能損傷。

圖 4 3 組大鼠 pJAK2、tJAK2、Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較 （a：pJAK2、tJAK2、Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)的電泳圖；b：3 組大鼠pJAK2/tJAK2比較；c：3組大鼠Bax蛋白表達(dá)水平比較；d：3組大鼠Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較；與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與生理鹽水組比較，△P＜0.05）

如今越來越多的證據(jù)表明，JAK2在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制中具有關(guān)鍵作用，如阿爾茨海默病、脊髓損傷、腦缺血和SAH等[23,35-37]。目前已發(fā)現(xiàn)的4個(gè)JAK在細(xì)胞表面到細(xì)胞核的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。JAK1、JAK2是成熟神經(jīng)系統(tǒng)中主要的JAK成員，而JAK3、TYK2的表達(dá)量較低[38]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SAH模型建立后JAK2被激活，而富氫鹽水能夠抑制JAK2的激活并改善神經(jīng)功能損傷。既往研究表明，SAH后JAK2表達(dá)水平升高，與基底動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡相關(guān)[23]。Jiang等[39]發(fā)現(xiàn)注射JAK2抑制劑AG-490會(huì)增加凋亡神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)，且Bax、Caspase-3表達(dá)水平均明顯升高。本研究結(jié)果表明，注射富氫鹽水可增強(qiáng)JAK2的磷酸化，抑制JAK2的激活，下調(diào)Bax、Caspase-3的蛋白表達(dá)，從而抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生，減少SAH后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生；提示富氫鹽水通過調(diào)節(jié)JAK2信號(hào)通路從而在SAH中發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)。

綜上所述，富氫鹽水可以減輕SAH后的早期腦損傷，改善SAH后的神經(jīng)功能損傷，其作用機(jī)制部分通過抑制JAK2的激活實(shí)現(xiàn)。但本項(xiàng)研究存在一定的局限性：（1）只分析了大腦皮層，而氫氣抑制JAK2的激活應(yīng)當(dāng)在其他大腦區(qū)域如海馬體中進(jìn)行驗(yàn)證；（2）只研究了1種劑量和1個(gè)時(shí)間點(diǎn)。將來研究會(huì)在富氫鹽水多種劑量、多個(gè)治療時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行展開。

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