雙Schiff-Base取代的3,5-二(芳亞甲基)-4-哌啶酮衍生物的合成及活性研究

姚彬榮，劉方正，劉 巖，楊 威，侯 迷，陳 琴，王春華，侯桂革

(濱州醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003)

圖1 3,5-二(芳亞甲基)-4-哌啶酮衍生物的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of 3,5-bis(arylidene)-4-piperidone derivatives

近年來(lái)醫(yī)療技術(shù)得到迅猛發(fā)展，但腫瘤仍是具有挑戰(zhàn)性的健康問(wèn)題。姜黃素已被證實(shí)具有較好的抗腫瘤活性，但其化學(xué)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、生物利用度低[1-4]，因此對(duì)其重要的α,β-不飽和酮藥效團(tuán)進(jìn)行衍生化研究具有重要意義。3,5-二(芳亞甲基)-4-哌啶酮是一類(lèi)α,β-不飽和酮與β-氨基酮相結(jié)合的新型姜黃素類(lèi)似物，其結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)α,β-不飽和酮藥效團(tuán)A，可與腫瘤細(xì)胞中的巰基發(fā)生兩次連續(xù)的烷基化反應(yīng)，這是此類(lèi)藥物與腫瘤細(xì)胞的主要結(jié)合位點(diǎn)，而當(dāng)中心哌啶酮的氮原子被其它基團(tuán)取代后,則形成一個(gè)輔助結(jié)合位點(diǎn)B。分子兩側(cè)的芳香基團(tuán)若有其它活性基團(tuán)取代，則對(duì)于整個(gè)分子與腫瘤靶點(diǎn)的結(jié)合更加有利，可形成輔助結(jié)合位點(diǎn)C。3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的協(xié)調(diào)作用，可以有效地提高分子的細(xì)胞毒活性[5-7]。Shoji等[8]研究發(fā)現(xiàn)，3,5-二(2-氟苯亞甲基)-4-哌啶酮(EF24,圖1)在MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞和DU-145人前列腺癌細(xì)胞中通過(guò)依賴(lài)氧化還原機(jī)制引起細(xì)胞周期停止和凋亡，從而發(fā)揮抗癌作用。Yadav等[9]研究了EF24在表達(dá)IL-1受體的低容血量休克的大鼠模型上的藥物作用，發(fā)現(xiàn)EF24可有效調(diào)節(jié)IL-1受體途徑。Dimmock等[10]研究發(fā)現(xiàn)3,5-二(芳亞甲基)-4-哌啶酮中兩個(gè)芳環(huán)為構(gòu)象E時(shí)抗腫瘤活性較好。Awasthi等[11]研究發(fā)現(xiàn)3,5-二(芳亞甲基)-4-哌啶酮衍生物(CLEFMA)能通過(guò)氧化應(yīng)激機(jī)制引起肺腺癌H441細(xì)胞的自我吞噬。另外,Zhou等[12]報(bào)道了一系列不對(duì)稱(chēng)的3,5-二(芳亞甲基)-4-哌啶酮化合物(MACs)可通過(guò)抑制Beas-2B細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-1β和VCAM-1 等炎癥因子的mRNA表達(dá)起到抗炎作用，從而對(duì)急性肺損傷(ALI)具有治療作用。

本課題組設(shè)計(jì)并合成了一系列3,5-二(芳亞甲基)-4-哌啶酮衍生物，并通過(guò)評(píng)價(jià)其對(duì)腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒性及抗腫瘤活性，篩選出部分體外抗腫瘤活性和抗多藥耐藥活性的化合物，進(jìn)一步系統(tǒng)研究了該類(lèi)化合物的構(gòu)效關(guān)系[13-17]。研究發(fā)現(xiàn)，將多酚類(lèi)芳醛與氨基取代的3,5-二(芳亞甲基)-4-哌啶酮縮合得到雙Schiff-Base化合物，可對(duì)THP-1顯示較好的抑制活性，而多鹵素取代的3,5-二(芳亞甲基)-4-哌啶酮衍生物及其活性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為系統(tǒng)研究該類(lèi)化合物的構(gòu)效關(guān)系，尋找低毒高效的抗腫瘤藥物，本文通過(guò)Claisen-Schmidt縮合、SnCl2/HCl還原以及Schiff-Base縮合反應(yīng)得到一系列雙Schiff-Base取代的3,5-二(芳亞甲基)-4-哌啶酮衍生物，并對(duì)其抗腫瘤活性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

N-甲基-4-哌啶酮、各種芳醛均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；阿霉素(DOX)購(gòu)于濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院。Frontier FT-IR型傅立葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Perkin Elmer公司，KBr壓片)；Bruker DPX-400型核磁共振儀(德國(guó)Bruker公司，以CDCl3或DMSO-d6作為溶劑)，SGW X-4 顯微熔點(diǎn)儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。分子對(duì)接采用SYBYL-X 2.0軟件(美國(guó)Tripos公司)。

1.2 化合物3a-i的合成

于50 mL圓底燒瓶中，將N-甲基-3,5-二(3-氨基苯亞甲基)-4-哌啶酮(0.32 g,1.0 mmol)分別與2,4-二氟苯甲醛(0.29 g,2.0 mmol)、2,5-二氟苯甲醛(0.29 g,2.0 mmol)、3,5-二氟苯甲醛(0.29 g,2.0 mmol)、4-氯苯甲醛(0.28 g,2.0 mmol)、2,4-二氯苯甲醛(0.35 g,2.0 mmol)、3,4-二氯苯甲醛(0.35 g,2.0 mmol)、4-溴苯甲醛(0.37 g,2.0 mmol)、2-溴-4氟苯甲醛(0.41 g,2.0 mmol)、2-溴-3-羥基苯甲醛(0.40 g,2.0 mmol)溶于15 mL甲醇中，滴加兩滴甲酸，常溫下攪拌反應(yīng)8 h (TLC跟蹤反應(yīng)進(jìn)程)，抽濾，水洗，干燥得黃色固體3a-i。

(3E,5E)-N-甲基-3,5-二[3-(2,4-二氟苯基亞甲基氨基)苯亞甲基]-4-哌啶酮(3a)，產(chǎn)率70%，熔點(diǎn)147～149 ℃,1H NMR(400 MHz,DMSO-d6,25 ℃,TMS,ppm):δ8.75(s,2H),8.18(dd,J=15.6,8.0 Hz,2H),7.66(s,2H),7.53(t,J=7.7 Hz,2H),7.46(d,J=9.4 Hz,2H),7.44-7.37(m,4H),7.35(d,J=7.8 Hz,2H),7.26(t,J=8.0 Hz,2H),3.77(s,4H),2.40(s,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3):δ186.8,165.1(dd,J=255.1,12.4 Hz),163.2(dd,J=256.5,12.3 Hz),153.0,152.0,136.3,136.0,133.6,129.5(t,J=4.1 Hz),129.4,128.2,122.9,121.2,120.4(dd,J=9.3,3.7 Hz),112.4(dd,J=21.8,3.5 Hz),104.2(t,J=25.2 Hz),57.0,45.8。IR(cm-1):2 780(br),1 674(m),1 617(s),1 587(s),1 500(s),1 428(m),1 266(m),1 221(s),1 186(s),1 138(s),1 088(s),964(s),922(m),889(m),849(s),815(m),790(s),728(m),690(s)。元素分析(%):C34H25F4N3O,理論值:C 71.95,H 4.44,N 7.40;測(cè)量值:C 71.89,H 4.45,N 7.37。

(3E,5E)-N-甲基-3,5-二[3-(2,5-二氟苯基亞甲基氨基)苯亞甲基]-4-哌啶酮(3b),產(chǎn)率63%,熔點(diǎn)146～148 ℃,1H NMR(400 MHz,DMSO-d6,25 ℃,TMS,ppm):δ8.77(s,2H),7.82(s,2H),7.66(s,2H),7.58-7.33(m,12H),3.77(s,4H),2.39(s,3H)。13C NMR(100 MHz,DMSO-d6):δ186.8,156.0(dd,J=241.3,1.6 Hz),157.5(d,J=240.5,1.5 Hz),153.9,151.5,136.2,134.8,134.6,130.1,128.9,125.2(dd,J=12.0,7.6 Hz),123.4,122.5,120.8(dd,J=24.8,9.1 Hz),118.7(dd,J=23.9,8.5 Hz),113.7(dd,J=25.1,2.9 Hz),56.7,45.7。IR(cm-1):2 780(br),1 674(m),1 622(s),1 587(s),1 486(s),1 267(m),1 245(s),1 187(s),1 156(m),1 140(m),1 100(m),954(m),895(s),804(s),791(s),731(s),690(s)。元素分析(%):C34H25F4N3O,理論值:C 71.95,H 4.44,N 7.40;測(cè)量值:C 71.99,H 4.51,N 7.48。

(3E,5E)-N-甲基-3,5-二[3-(3,5-二氟苯基亞甲基氨基)苯基亞甲基]-4-哌啶酮(3c),產(chǎn)率69%,熔點(diǎn)143～145 ℃,1H NMR(400 MHz,DMSO-d6,25 ℃,TMS,ppm):δ8.77(s,2H),7.82(s,2H),7.66(s,2H),7.58-7.29(m,12H),3.77(s,4H),2.39(s,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3):δ186.8,164.1(d,J=257.0 Hz),158.6,151.8,136.3,136.0,133.6,130.6(d,J=9.1 Hz),129.4,128.3,122.8,121.5,120.4(d,J=24.7 Hz),115.5(d,J=21.5 Hz),57.1,45.9。IR(cm-1):1 674(m),1 622(s),1 587(s),1 487(s),1 436(w),1 267(m),1 246(s),1 221(m),1 187(s),1 140(m),1 100(m),966(w),916(m),895(s),805(s),791(s),732(s),690(s)。元素分析(%):C34H25F4N3O,理論值:C 71.95,H 4.44,N 7.40;測(cè)量值:C 72.02,H 4.39,N 7.45。

(3E,5E)-N-甲基-3,5-二[3-(4-氯苯基亞甲基氨基)苯亞甲基]-4-哌啶酮(3d),產(chǎn)率64%,熔點(diǎn)149～151 ℃,1H NMR(400 MHz,CDCl3,25 ℃,TMS,ppm):δ8.45(s,2H),7.86(m,6H),7.49(m,6H),7.30(m,2H),7.21(m,2H),3.82(s,4H),2.49(s,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3):δ186.4,159.2,151.6,137.7,135.9,135.7,134.0,133.1,129.7,129.0,128.7,127.6,122.4,120.8,56.6,45.5。IR(cm-1):2 780(br),1 674(m),1 632(s),1 586(s),1 490(s),1 283(s),1 245(m),1 184(s),1 155(m),1 088(s),974(s),953(m),913(m),860(m),826(s),795(s),691(s)。元素分析(%):C34H27Cl2N3O,理論值:C 72.34,H 4.82,N 7.44;測(cè)量值:C 72.30,H 4.77,N 7.49。

(3E,5E)-N-甲基-3,5-二[3-(2,4-二氯苯基亞甲基氨基)苯亞甲基]-4-哌啶酮(3e),產(chǎn)率68%,熔點(diǎn)164～166 ℃,1H NMR(400 MHz,CDCl3,25 ℃,TMS,ppm):δ8.88(s,2H),8.23(d,J=8.5 Hz,2H),7.89(s,2H),7.49(m,4H),7.38(d,J=8.4 Hz,2H),7.31(d,J=7.5 Hz,2H),7.25(m,4H),3.87(s,4H),2.51(s,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3):δ186.3,156.0,151.4,137.5,136.3,135.9,135.6,133.2,131.2,129.4,129.1,129.1,128.0,127.3,122.5,121.1,56.7,45.5。IR(cm-1):1 671(m),1 616(s),1 584(s),1 471(m),1 287(m),1 189(s),1 134(m),1 098(s),972(m),957(w),921(m),890(w),866(s),821(m),792(m),690(s)。元素分析(%):C34H25Cl4N3O,理論值:C 64.47,H 3.98,N 6.63;測(cè)量值:C 64.49,H 3.90,N 6.59。

(3E,5E)-N-甲基-3,5-二[3-(3,4-二氯苯基亞甲基氨基)苯亞甲基]-4-哌啶酮(3f),產(chǎn)率72%,熔點(diǎn)107～109 ℃,1H NMR(400 MHz,DMSO-d6,25 ℃,TMS,ppm):δ8.70(s,2H),8.17(s,2H),7.94(d,J=8.1 Hz,2H),7.82(d,J=8.2 Hz,2H),7.66(s,2H),7.55(t,J=7.6 Hz,2H),7.41(d,J=12.2 Hz,4H),7.35(d,J=7.7 Hz,2H),3.78(s,4H),2.41(s,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3):δ186.4,159.4,151.1,136.5,135.7,134.4,134.2,134.0,131.8,131.3,130.3,129.7,128.5,128.4,123.1,122.0,56.3,45.3。IR(KBr Pellet cm-1):1 671(m),1 613(s),1 583(s),1 470(s),1 279(s),1 206(m),1 183(s),1 127(m),1 058(m),975(w),909(w),821(m),788(m),699(s)。元素分析(%):C34H25Cl4N3O,理論值:C 64.47,H 3.98,N 6.63;測(cè)量值:C 64.43,H 4.05,N 6.67。

(3E,5E)-N-甲基-3,5-二[3-(4-溴苯基亞甲基氨基)苯亞甲基]-4-哌啶酮(3g),產(chǎn)率68%,熔點(diǎn)147～149 ℃,1H NMR(400 MHz,CDCl3,25 ℃,TMS,ppm):δ8.43(s,2H),7.86(s,2H),7.81(d,J=8.0 Hz,4H),7.65(d,J=8.0 Hz,4H),7.47(t,J=7.5 Hz,2H),7.29(d,J=10.4 Hz,2H),7.22(m,4H),3.82(s,4H),2.49(s,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3):δ186.4,159.3,151.5,135.9,135.7,134.4,133.1,131.7,129.8,129.0,127.2,125.8,122.4,120.8,56.6,45.4。IR(cm-1):1 673(m),1 623(s),1 585(s),1 486(s),1 284(s),1 207(m),1 183(s),1 097(s),974(m),953(m),912(m),885(m),856(m),814(s),795(s),690(s)。元素分析(%):C34H27Br2N3O,理論值:C 62.50,H 4.17,N 6.43;測(cè)量值:C 62.46,H 4.15,N 6.38。

(3E,5E)-N-甲基-3,5-二[3-(2-溴-4-氟苯基亞甲基氨基)苯亞甲基]-4-哌啶酮(3h),產(chǎn)率67%,熔點(diǎn)134～136 ℃,1H NMR(400 MHz,CDCl3,25 ℃,TMS,ppm):δ8.82(s,2H),8.28(dd,J=8.5,6.5 Hz,2H),7.87(s,2H),7.49(t,J=8.0 Hz,2H),7.40(dd,J=8.0,1.9 Hz,2H),7.32(d,J=7.6 Hz,2H),7.26(s,4H),7.18(dd,J=11.7,4.6 Hz,2H),3.83(s,4H),2.50(s,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3):δ186.8,164.1(d,J=257.1 Hz),158.7,151.8,136.3,136.0,133.6,130.8(d,J=3.4 Hz),130.6(d,J=9.0 Hz),129.4,128.3,126.5(d,J=9.8 Hz),122.8,121.6,120.4(d,J=24.7 Hz),115.5(d,J=21.5 Hz),57.1,45.9。IR(cm-1):1 671(m),1 616(m),1 586(s),1 484(s),1 282(m),1 217(s),1 189(s),1 061(m),975(m),956(m),920(m),889(m),855(s),823(m),787(s),690(s)。元素分析(%):C34H25Br2F2N3O,理論值:C 59.24,H 3.66,N 6.10;測(cè)量值:C 59.26,H 3.57,N 6.13。

(3E,5E)-N-甲基-3,5-二[3-(2-溴-3-羥基苯基亞甲基氨基)苯亞甲基]-4-哌啶酮(3i),產(chǎn)率為71%,熔點(diǎn)137～139 ℃,1H NMR(400 MHz,DMSO-d6,25 ℃,TMS,ppm):δ10.59(s,2H),8.86(s,2H),7.66(s,2H),7.61(d,J=7.5 Hz,2H),7.54(t,J=7.6 Hz,2H),7.42(d,J=7.5 Hz 2H),7.30(m,6H),7.14(d,J=7.8 Hz，2H),3.79(s,4H),2.41(s,3H)。13C NMR(100 MHz,DMSO-d6):δ192.2,160.6,154.6,151.7,135.8,135.1,134.4,134.2,129.8,128.7,128.3,122.7,121.9,119.1,118.8,113.7,56.4,45.3。IR(cm-1):3 085(br),1 666(w),1 602(s),1 565(s),1 460(m),1 425(m),1 298(s),1 218(s),1 182(s),1 026(m),940(m),918(m),889(m),826(m),785(m),687(s)。元素分析(%):C34H27Br2N3O3,理論值:C 59.58,H 3.97,N 6.13;測(cè)量值:C 59.63,H 3.94,N 6.15。

1.3 抗腫瘤活性測(cè)試

選用9種腫瘤細(xì)胞系：SGC-7901(胃癌細(xì)胞)、A549(肺癌細(xì)胞)、HCT116(結(jié)腸癌)、HeLa(宮頸癌細(xì)胞)、HePG2(肝癌細(xì)胞)、K562(人慢性骨髓性白血病細(xì)胞)、THP-1(人急性單核粒細(xì)胞白血病細(xì)胞)、U937(組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞)、MCF-7(乳腺癌細(xì)胞)。1種正常細(xì)胞株：LO2(人正常肝細(xì)胞)。采用MTT法進(jìn)行活性測(cè)試：取1×104/100 μL的細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)24 h，加入一定濃度梯度的合成化合物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將96孔板中的溶液除去，加入已配制的MTT溶液200 μL (培養(yǎng)基∶MTT=9∶1，體積比)，37 ℃孵育4 h，棄上清液，加入150 μL DMSO 37 ℃搖床孵育10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在570 nm處的吸光度，計(jì)算IC50。合成化合物及陽(yáng)性對(duì)照DOX的濃度梯度為10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25、0.078、0.039、0.019 5 μg/mL。

1.4 分子對(duì)接模擬

3b、3i對(duì)接入Bcl-2(PDB:1YSW)蛋白結(jié)構(gòu)。分子對(duì)接選用SYBYL-X 2.0軟件(Triops公司)的Surflex-Dock 模塊，所有對(duì)接操作在SYBYL-X 2.0藥物設(shè)計(jì)軟件中的Surflex-Dock程序下按默認(rèn)值完成。配體小分子3b、3i均在Chem3D中形成3D構(gòu)象，采用Tripos力場(chǎng)分子力學(xué)程序Minimize進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，負(fù)載Gasteiger-Hückel電荷，以Powl能量梯度法進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，優(yōu)化后得到穩(wěn)定構(gòu)象[18]。通過(guò)PyMol和Ligplus分析兩者對(duì)接的結(jié)合方式和相互作用力。

圖2 3a-i的合成和結(jié)構(gòu)Fig.2 Synthesis and structures of 3a-i

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)部分

本文以N-甲基-4-哌啶酮和3-硝基苯甲醛為原料，通過(guò)Claisen-Schmidt縮合反應(yīng)得到N-甲基-3,5-二(3-硝基苯亞甲基)-4-哌啶酮中間體1；然后，用SnCl2/鹽酸還原得到N-甲基-3,5-二(3-氨基基苯亞甲基)-4-哌啶酮中間體2；最后，與一系列鹵代苯甲醛通過(guò)Schiff-Base縮合反應(yīng)得到3a-i(圖2)，產(chǎn)率為64%～72%。中間體1和2的譜圖數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致[16-17]?；衔?a-i利用NMR、IR、元素分析等手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，結(jié)果顯示其在DMSO、DMF、二氯甲烷、丙酮、甲醇、乙醇中有較好的溶解度，但幾乎不溶于水。

2.2 抗腫瘤活性分析

本文采用MTT法，評(píng)價(jià)藥物對(duì)SGC-7901、A549、HCT116、HeLa、HePG2、K562、THP-1、U937、MCF-7等細(xì)胞系的抗腫瘤活性及對(duì)LO2的細(xì)胞毒性。從表1得知，3a-i對(duì)上述9種腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出顯著的抑制活性，部分化合物對(duì)某些細(xì)胞的IC50值小于1.0 μmol/L。3a-i對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制活性明顯優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥DOX(阿霉素，IC50=7.37±0.59 μmol/L)，特別是具有雙F取代基的化合物3a和具有間Br取代基的化合物3g的IC50值僅為(2.25±0.37) μmol/L和(2.03±0.12) μmol/L，更有意義的是，3a對(duì)LO2的IC50值可達(dá)(12.53±0.94) μmol/L，比DOX的IC50值(10.32±0.92 μmol/L)略大。對(duì)于A549細(xì)胞，具有雙F取代基的化合物3a(1.33±0.05 μmol/L)和3b(1.46±0.30 μmol/L)的活性明顯優(yōu)于其他化合物，且比DOX(3.83±0.16 μmol/L)的活性更好。對(duì)于HCT116細(xì)胞，化合物3b和3f的活性在這一系列化合物中最好，且活性?xún)?yōu)于DOX(10.87±2.53 μmol/L)；對(duì)于HeLa細(xì)胞，化合物的活性幾乎與DOX相當(dāng)，其中具有雙F取代基的化合物3a-c活性?xún)?yōu)于其他化合物，特別是3c(1.75±0.16 μmol/L)的活性最好；對(duì)于HePG2細(xì)胞，除了3e的抑制活性較差外，IC50值達(dá)(7.14±0.46) μmol/L，其他化合物的抑制活性明顯優(yōu)于DOX，并且化合物3i的活性最佳，IC50值僅為(1.09±0.18) μmol/L。對(duì)K562細(xì)胞，3a、3d、3f、3i的IC50值小于1.0 μmol/L，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性。對(duì)THP-1細(xì)胞，3a、3b、3f、3i化合物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，其IC50值均小于1.0 μmol/L。其中具有雙F取代基的化合物3b的IC50值為(0.31±0.01) μmol/L，低于DOX。其它化合物對(duì)THP-1的抑制活性劣于DOX。對(duì)U937細(xì)胞，鄰-Br取代的化合物3h和3i的抑制活性較好，優(yōu)于DOX；對(duì)MCF-7細(xì)胞，該類(lèi)化合物的IC50值較大，抑制活性明顯次于DOX。對(duì)LO2的細(xì)胞毒性分析顯示，化合物3a，d-f的細(xì)胞毒性較小，它們的IC50值比DOX更大，并且細(xì)胞毒性明顯低于文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)構(gòu)相似的化合物[16-17]。另外，對(duì)于化合物3g-i，化合物3i抑制腫瘤細(xì)胞的活性較好，這可能與化合物3i中的酚羥基具有潛在的抗氧化、清除活性自由基的作用密不可分。結(jié)構(gòu)分析顯示，具有雙F取代基的化合物3a-c的抑制活性相對(duì)其他化合物好，說(shuō)明氟取代對(duì)于雙Schiff-Base取代的3,5-二(芳亞甲基)-4-哌啶酮衍生物的抗腫瘤活性有利。

表1 抗腫瘤活性和細(xì)胞毒性Table 1 Antitumor activity and cytotoxicity

(續(xù)表1)

2.3 對(duì)Bcl-2及BAX表達(dá)的影響

抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子BAX是引起細(xì)胞凋亡的重要基因，Bcl-2能夠阻止細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，從而抑制細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生，而B(niǎo)AX的過(guò)度表達(dá)可拮抗Bcl-2的保護(hù)效應(yīng)而使細(xì)胞趨于死亡[19-20]。Anant等[21]研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的EF24能有效抑制抗凋亡基因Bcl-xL和Bcl-2的表達(dá)，但不影響促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡基因BAX的表達(dá)，從而導(dǎo)致Bcl-xL/BAX和Bcl-2/BAX的蛋白比例呈下降趨勢(shì)。如圖3所示，化合物3a-c和3i能有效降低Bcl-2的表達(dá)和升高BAX的表達(dá)。

圖3 qPCR檢測(cè)化合物3a-i對(duì)THP-1細(xì)胞中Bcl-2(A)和BAX(B)蛋白基因表達(dá)的影響，以及Western Blot驗(yàn)證3a-c和3i對(duì)Bcl-2和BAX蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of compounds 3a-i on the expression level of resistance gene Bcl-2 (A) and BAX (B) detected by qPCR and Western Blot (C)the control is THP-1 untreated with any compounds(未用藥物處理的THP-1作為空白對(duì)照)

2.4 分子對(duì)接

Bcl-2蛋白是重要的抗腫瘤藥物作用靶點(diǎn)[19-20]，抑制劑與Bcl-2結(jié)合的重要驅(qū)動(dòng)力分別是疏水作用力和氫鍵相互作用力(圖4中虛線所示)。P1、P2口袋是Bcl-2(PDB:1YSW)蛋白中活性腔內(nèi)較大的兩個(gè)口袋，P3、P4是活性腔兩端較小的兩個(gè)口袋，而L1是一個(gè)相對(duì)較窄的P1和P2連接部位。如圖4A所示，化合物3b的兩個(gè)2,5-二氟苯亞氨基能與P1和P2口袋相吻合，而中心的3,5-二(芳亞甲基)-4-哌啶酮基團(tuán)穿越L1連接部位，與Bcl-2蛋白上的ARG-143片段形成強(qiáng)的氫鍵(圖4B中虛線所示)，Pro-43等氨基酸殘基與化合物3b形成12個(gè)疏水鍵[22](圖4C中弧形鋸齒線所示)。而化合物3i因末端有酚羥基，與GLY-142形成穩(wěn)定的氫鍵(圖4D和圖4E中虛線所示)，與Pro-42等氨基酸殘基形成10個(gè)疏水鍵(圖4F中弧形鋸齒線所示)，分子中心的3,5-二(芳亞甲基)-4-哌啶酮基團(tuán)則與P1口袋結(jié)合，另一側(cè)的端基2-溴-3-羥基苯亞氨基基團(tuán)則與P4口袋結(jié)合，從而表現(xiàn)出較好的抑制活性。

圖4 化合物3b (A、B、C)和3i (D、E、F)與Bcl-2(PDB:1YSW)蛋白的對(duì)接模型Fig.4 Molecular docking mode of compound 3b (A，B，C) and 3i (D，E，F(xiàn)) in the active site of Bcl-2 protein

3 結(jié) 論

本文合成了一系列雙Schiff-Base取代的3,5-二(芳亞甲基)-4-哌啶酮衍生物3a-i。此類(lèi)化合物對(duì)SGC-7901、A549、HCT116、HeLa、HePG2、K562、THP-1、U937、MCF-7等腫瘤細(xì)胞顯示出顯著的抑制活性。部分化合物對(duì)某些細(xì)胞的IC50值小于1.0 μmol/L。另外，化合物3a、d-f對(duì)LO2的細(xì)胞毒性比DOX小。構(gòu)效關(guān)系顯示，F(xiàn)取代的化合物3a-c活性?xún)?yōu)于Br和Cl取代的化合物3d-i。分子對(duì)接模型證實(shí)化合物3b和3i對(duì)Bcl-2蛋白有顯著的抑制作用。

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