超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法快速測定火鍋底料中的5種罌粟殼生物堿殘留

李興根，喬勇升，陳 偉，馮寅潔，朱 淵，胡 慧

(1.泰州市產品質量監(jiān)督檢驗院，江蘇 泰州 225300；2.泰州市食品藥品檢驗所，江蘇 泰州 225300)

罌粟殼為罌粟科植物罌粟(Papaversomniferum)采完鴉片后的干燥成熟果殼，含有20多種生物堿，其中以嗎啡(Morphine)、可待因(Codeine)、那可丁(Narcotine)、罌粟堿(Papaverine)、蒂巴因(Thebaine)等為主要成分[1]。由于罌粟殼的易成癮性，國內部分不法商販將其加入火鍋底料、小吃調料等食品中，以達到吸引消費者的目的。消費者長期食用含有罌粟殼的食物容易成癮，還會對人體神經系統(tǒng)造成損害，并可能造成慢性中毒[2]。鑒于其危害，2008年中國衛(wèi)生部將罌粟殼列于《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)》[3]中，禁止在食品中違法添加，并對其進行嚴格監(jiān)管。

目前，測定罌粟殼生物堿的方法主要有分光光度法[4]、薄層色譜法[5]、氣相色譜法[6-7]、高效液相色譜法[8-9]、氣相色譜-質譜聯(lián)用法[10-11]和液相色譜-質譜聯(lián)用法[12-17]。國內針對罌粟殼生物堿的檢測標準僅有上海市地方標準DB31/2010-2012[18]，該標準使用QuEChERS方法對樣品進行提取凈化，液相色譜-串聯(lián)質譜法測定分析。該方法需兩步提取凈化，并且針對成分復雜的火鍋底料或調味料樣品，經過兩個步驟的提取凈化后，部分樣品仍顏色較深，凈化效果不理想。由于火鍋底料含有較多的脂肪和磷脂，極大地干擾目標化合物的分析，因此，有效去除脂肪和磷脂是前處理的關鍵。本文使用對脂肪類物質有較好凈化作用的Oasis PRiME HLB固相萃取小柱，采用通過式凈化方式去除樣品中干擾物，獲得了理想的凈化效果，使樣品前處理過程更加簡便省時，適合大批量的日常分析檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀、Waters Xevo TQ-S三重四極桿質譜儀(美國Waters公司)，Allegra 64R冷凍臺式高速離心機(美國Beckman Coulter公司)，Milli-Q Reference 超純水機(美國Millipore公司)，XS204型電子分析天平，感量為0.000 01 g(瑞士Mettler Toledo公司)，JP-100超聲波清洗器(深圳市潔盟清洗設備有限公司)。

嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿和那可丁5種生物堿混合標準溶液購自美國O2si smart solutions公司(質量濃度分別為50.5、50.15、10.04、9.987、10.08 mg/L，批號271423)。甲醇、乙腈(色譜純，西班牙Scharlau公司)，甲酸、乙酸銨(LC MS級試劑，美國Anaqua公司)，氨水(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。Oasis PRiME HLB固相萃取柱(6 mL，200 mg，美國Waters 公司)。尼龍針式濾膜(0.22 μm，天津津騰公司)。氮氣、氬氣(>99.999%)。實驗所用樣品來源于流通和餐飲市場。

1.2 標準溶液的制備

生物堿混合標準溶液于-18 ℃冷凍保存，使用前以空白基質提取液稀釋配制成濃度合適的混合標準工作溶液，置于棕色瓶中，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY UPLCTMBHE C18柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)；流動相:A：乙腈,B：氨水溶液(pH 8.0)。梯度洗脫程序：0～1.0 min，8%A；1.0～1.2 min，8%～35%A；1.2～2.4 min，35%～70%A；2.4～2.5 min，70%～90%A；2.5～3.9 min，90%A；3.9～4.0 min，90%～8%A；4.0～5.0 min，8%A。進樣量10 μL，柱溫30 ℃，流速0.3 mL/min。

1.3.2質譜條件離子源：電噴霧離子(ESI)源；正離子模式；毛細管電壓：3.0 kV；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：300 ℃；RF透鏡電壓：0.5 V；脫溶劑氣流速：600 L/h；錐孔氣流速：50 L/h；采集模式：MRM采集，其他參數(shù)見表1。

表1 5種罌粟殼生物堿的質譜參數(shù)Table 1 MS-MS conditions for five alkaloids of poppy husk

*quantification ion

1.4 樣品前處理

稱取均質后樣品2 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入20 mL含0.2%甲酸的乙腈，旋渦混合30 s，超聲提取5 min，在5 000 r/min下離心5 min。取上清液2 mL過 PRiME HLB小柱，5 mL乙腈洗凈小柱殘留，吹干柱床收集全部濾液。濾液經氮氣吹干后加入2 mL含0.1%甲酸的乙腈-水(50∶50，體積比)溶解殘渣，過0.22 μm有機相濾膜，待測。

空白基質提取液的配制：根據(jù)配制標準工作曲線的使用量，稱取適量空白基質樣品，按上述步驟處理，得到的空白基質提取液用于標準工作曲線配制。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

采用直接進樣方式，在電噴霧正離子模式下分析嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁5種生物堿，通過優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量等儀器參數(shù)，選取豐度高、干擾小的子離子作為定性、定量離子，建立多離子反應監(jiān)測(MRM)方法。5種生物堿的母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量等質譜參數(shù)見表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

5種生物堿分子結構各不相同(圖1)，其極性差異較大。嗎啡和可待因的分子結構式非常相似，二者的差異僅在與苯環(huán)相連的1個基團(羥基，甲氧基)，酚羥基的存在使嗎啡和可待因易溶于水，而極性較弱的罌粟堿在水中略溶，蒂巴因、那可丁則幾乎不溶于水。由于分子結構中兩個酚羥基的存在，使得嗎啡在5種生物堿中極性最強。實驗發(fā)現(xiàn)在酸性流動相條件下，嗎啡在普通C18色譜柱上無保留。本研究嘗試在中性或堿性條件下分離，參考已報道的文獻[12,15]，選擇兩種流動相進行比較，一種流動相為10 mmol/L乙酸銨水溶液(pH 7.0)和乙腈，另一種流動相為pH 8.0氨水溶液和乙腈。5種生物堿在兩種流動相體系中分別使用Waters UPLC HSS T3(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)和Waters BHE C18色譜柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)進行分離。

圖1 罌粟殼中5種生物堿的化學結構Fig.1 Chemical structures of five alkaloidsA.morphine,B.codeine,C.narcotine,D.papaverine,E.thebaine

圖2 5種罌粟殼生物堿混合標準溶液(罌粟堿、那可丁、蒂巴因濃度10 μg/L，嗎啡、可待因濃度50 μg/L)的定量離子色譜圖Fig.2 Quantitative ion chromatograms of five alkaloids of poppy husk in a standard solution(the concentrations are 10 μg/L for papaverine,narcotine,thebaine and 50 μg/L for morphine,codeine)

實驗發(fā)現(xiàn)5種生物堿在弱堿性流動相中的色譜峰峰形更好，電離信號強度較高，嗎啡和可待因的信號強度甚至有5倍以上的差距。但5種生物堿在弱堿性流動相中電離信號強度的增加降低了方法的檢出限，也導致罌粟堿和那可丁在濃度較高時標準曲線彎曲，線性范圍較窄，只能在0.05～10 μg/L內保持良好線性關系，實際工作中需將陽性樣品濃度調整到標準曲線范圍內進行測定。在弱堿性流動相中，使用HSS T3或C18色譜柱均能得到理想的分離效果。綜合考慮，最終選擇pH 8.0氨水溶液和乙腈作為流動相，使用Waters BHE C18色譜柱分離，并優(yōu)化了梯度洗脫程序、流速、柱溫等色譜參數(shù)，確定了最佳的色譜條件，5種生物堿的定量離子色譜圖如圖2所示。

圖3 5種罌粟殼生物堿在采用不同提取溶劑時的提取效率Fig.3 Extraction efficiencies of five alkaloids of poppy husk with different solventsA:acetonitrile-water(80∶20) containing 0.2% formic acid;B:acetonitrile containing 0.2% formic acid; C:acetonitrile-water(80∶20);D:acetonitrile

2.3 凈化方法的選擇

由于火鍋底料成分復雜，其中含有大量油脂、蛋白質、鹽類及其他種類繁多的香辛調味料成分，這些組分的存在會干擾目標化合物的測定，同時縮短色譜柱壽命，因此對提取液進行有效凈化成為前處理的關鍵步驟。目前，針對罌粟堿等生物堿的前處理常采用MCX固相萃取柱法[14-15]和基質分散固相萃取法[12-13,16-17]，上海地方標準DB31/2010-2012[18]采用后者進行處理。實驗發(fā)現(xiàn)，基質分散固相萃取法操作較為簡便，但經其凈化所得的濾液常呈深或淺偏黃的顏色，針對成分復雜的火鍋底料樣品不能獲得滿意的凈化效果。而MCX固相萃取柱除油脂效果不理想且操作較繁瑣。由于生物堿在酸性條件下形成鹽類易溶于水，本實驗嘗試采用酸性乙腈水溶液提取樣品中的生物堿，并使用對脂肪蛋白質有吸附作用的PRiME HLB固相萃取小柱進行凈化，發(fā)現(xiàn)5種罌粟殼生物堿在此柱上均不被吸附，可以使用通過式策略進行凈化，并獲得了滿意的凈化效果，縮短了檢測周期，且操作更為簡便。

2.4 提取溶劑的選擇

由于5種生物堿極性差異較大，本文比較了含0.2%甲酸的乙腈-水(80∶20)、含0.2%甲酸的乙腈、乙腈-水(80∶20)、純乙腈4種提取溶劑對生物堿的提取效率，結果如圖3所示。

由圖3可知，對于幾乎不溶于水的蒂巴因和那可丁，使用含0.2%甲酸的乙腈作為提取溶劑時提取效率最高；對于略溶于水的罌粟堿，純有機溶劑的提取效率高于乙腈-水(80∶20)的提取效率，含0.2%甲酸乙腈的提取效率最高；而對于易溶于水的可待因和嗎啡，不添加甲酸的乙腈和乙腈-水(80∶20)能獲得更高的提取效率。5種罌粟殼生物堿的提取效率受其極性影響很大，考慮到罌粟堿等生物堿在酸性條件下形成鹽類更穩(wěn)定，本實驗選擇含0.2%甲酸的乙腈作為生物堿的提取溶劑。

2.5 基質效應

使用LC-MS/MS法對成分復雜的樣品進行痕量分析時，基質效應是不容忽視的問題[19]?；疱伒琢现泻杏椭?、蛋白質、鹽及香辛調味料等，成分復雜，這些雜質的存在會影響測定結果的精密度和準確度。本文分別采用初始流動相和空白基質提取液配制生物堿標準曲線，考察了基質效應的影響。結果表明，當采用空白基質提取液配制標準曲線時，5種生物堿普遍存在基質抑制效應。為使定量分析更準確，實際檢測中采用空白基質提取液配制曲線以降低基質效應的影響。

2.6 方法學驗證

2.6.1線性關系采用空白基質提取液制備系列混合標準工作液，在本方法確定的實驗條件下進行UPLC-MS/MS分析。以質量濃度(x，μg/L)為橫坐標、定量離子峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程與相關系數(shù)(見表2)。結果表明，那可丁、罌粟堿在本實驗條件下的質譜靈敏度很高，但線性范圍較窄，只能在0.05～10 μg/L范圍內保持良好線性關系(r≥0.999 7)，嗎啡、可待因在0.25～100 μg/L范圍內保持良好線性關系(r≥0.999 0)，蒂巴因在0.05～100 μg/L范圍內保持良好線性關系(r≥0.999 8)。

表2 5種生物堿的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)(r)、檢出限和定量下限Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients(r)，limits of detection(LODs) and limits of quantitation(LOQs)of five alkaloids in poppy husk

*y：peak area；x：mass concentration(μg/L)

2.6.2檢出限與定量下限采用在空白基質樣品中添加生物堿標準物質的方法，設定目標物質定量離子色譜峰的檢出限(LOD，S/N=3)和定量下限(LOQ，S/N=10)，得出嗎啡和可待因的LOD為4.5 μg/kg,LOQ為15.0 μg/kg，罌粟堿、蒂巴因、那可丁的LOD為0.9 μg/kg、LOQ為3.0 μg/kg，結果如表2所示。

2.6.3回收率與精密度在超市購置火鍋調味底料樣品，選取經測定不含待測組分的空白基質樣品，添加3個濃度水平的混合標準工作液進行回收率試驗，每個濃度水平重復測定5次[20]，以基質空白工作曲線進行定量，計算方法的回收率及精密度(以相對標準偏差表示)，結果見表3。

表3 火鍋底料中5種生物堿的加標回收率和日內、日間相對標準偏差Table 3 Recovery,intra-day and inter-day precisions for five alkaloids in hot pot soup

由表3可知，在3個加標濃度水平下，生物堿的平均回收率為70.7%～109.6%，日內精密度為1.6%～7.5%，日間精密度為1.9%～10.3%。

2.7 實際樣品檢測

分別利用本研究建立的SPE/UPLC-MS/MS分析方法和DB31/2010-2012標準規(guī)定的方法對流通市場抽取的火鍋底料及鹵菜湯料樣品進行測定，均未檢出上述5種罌粟殼生物堿，未來將進一步擴大檢測范圍，加強監(jiān)管。

3 結 論

本文采用PRiME HLB固相萃取柱凈化火鍋底料調味品，并對色譜和質譜檢測條件進行優(yōu)化，建立了同時測定嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿和那可丁的UPLC-MS/MS方法。該方法前處理操作簡便、靈敏度高，適合對大批樣品的快速篩查檢測。同時，本方法針對食品非法添加物的檢測也具有一定的參考價值。

參考文獻：

[1] Chen W，Qiao Y S，Dong G J.Sci.Technol.Cereals,OilsandFoods(陳偉，喬勇升，董貴軍.糧油食品科技)，2015，(6)：89-91.

[2] Lu M L，Zhao C C，Cai J R，Zhao X L.Chin.J.HealthLab.Technol.(陸茂林，趙春城，蔡建榮，趙曉聯(lián).化學進展)，2005，17(5)：897-904.

[3] The list of Non-edible Substance and Abused Food Additives Which May be Illegal Added in Foods(First Batch)(食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批))[2008-12-15].http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohwsjdj/s3594/200812/38511.htm

[4] Zhang C Y.Chin.HealthLab.Technol.(張朝云.中國衛(wèi)生檢驗雜志)，1996，6(1)：53-54.

[5] Tu X M.J.Environ.Health(涂曉明.環(huán)境與健康雜志),1992，9(Suppl.1)：373-374.

[6] Li Y F，F(xiàn)u Y H，Hou X Y.Chin.J.HealthLab.Technol.(李永芳，付耀華，侯曉燕.中國衛(wèi)生檢驗雜志)，2000，10(1)：38-40.

[7] Qin Q F，Liu S L，Yang S L.J.Prevent.Med.Inf.(秦啟發(fā)，劉守亮，楊素林.預防醫(yī)學情報雜志)，2002，18(2)：187-188.

[8] Pi L，Hu F Z，Shi Z X.Chin.J.Chromatogr.(皮立，胡鳳祖，師治賢.色譜)，2005，23(6)：639-641.

[9] Xin H H，Wang T X，Zhu L J，Zhang X Y，Wang Y.Chin.FoodAddit.(信海紅，王庭欣，朱路甲，張曉宇，王羽.中國食品添加劑)，2012，(4)：250-252.

[10] Wang L L，Liu Z.Mod.Prevent.Med.(王莉莉，劉仲.現(xiàn)代預防醫(yī)學)，2005，32(1)：51.

[11] Zhang Y P，Liao H L，Xiao B，Chen Z.J.Hyg.Res.(張艷萍，廖華樂，肖兵，陳湛.衛(wèi)生研究)，2011，40(4)：512-513.

[12] Yang J，Wang Z，Zhang H Z，Zhai S X，Yu Z，Zhang F Y，Yin J Y，Wang X B.FoodSci.(楊潔，王智，張輝珍，翟士星，于宙，張鳳艷，殷冀煜，王曉斌.食品科學)，2014， 35(22)：243-246.

[13] Wang K，Zheng R，Jian L H，Mao D，Ji S.Chin.J.HealthLab.Technol.(王珂，鄭榮，簡龍海，毛丹，季申.中國衛(wèi)生檢驗雜志)，2011，21(2)：363-365.

[14] Wang L Q，Li M H，Li J Q，Chen H T， Fan Y，Zhao D X.FoodFerment.Ind.(王力清，酈明浩，李錦清，陳洪濤，樊垚，趙丹霞.食品與發(fā)酵工業(yè))，2012，38(8)：168-172.

[15] Liao W J，Zhang H，Ren Y P.Chin.J.Anal.Chem.(廖文娟，張虹，任一平.分析化學)，2006，34(8)：1175-1178.

[16] Mao D，Jian L H，Zheng R，Wang K，Ji S.J.Environ.Health(毛丹，簡龍海，鄭榮，王珂，季申.環(huán)境與健康雜志)，2012，29(1)：88.

[17] Liu M M，Zhang C Z，Li Y Z，Wen J X.FoodRes.Dev.(劉敏敏，張朝正，李延志，溫家欣.食品研究與開發(fā))，2013，34(1)：91-94.

[18] DB31/2010-2012.Food Safety Local Standard-Determination of Papaverine,Morphine,Codeine and Thebaine,Noscapine in Hot Pot Soup Liquid Chromatography-Mass Spectrometry.Local Standards of Shanghai City(食品安全地方標準-火鍋食品中罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法.上海市地方標準).

[19] Xiang P，Shen M，Zhuo X Y.J.Instrum.Anal.(向平，沈敏，卓先義.分析測試學報)，2009，28(6):753-756.

[20] Food and Drug Administration:U.S.Department of Health and Human Services.(2003) Guidance for Industry,Bioanalytical Method Validation.FDA,www.fda.gov/cder/guidance/4252fnl.pdf.Date accessed 30 October 2011.