5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性與結(jié)直腸癌化療致惡心嘔吐的易感性

魏宜勝 周亞光 王綺雯 張嘯 羅敏睿

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胃腸外科，外科實(shí)驗(yàn)室（廣州510260）

結(jié)直腸癌目前在國內(nèi)外發(fā)病率不斷上升［1-3］，一直位于各種惡性腫瘤發(fā)生率前列［4］。化療是控制結(jié)直腸癌進(jìn)展的重要手段，術(shù)后輔助化療可消除微小轉(zhuǎn)移灶，降低腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率、提高生存率［5］，但也引起了惡心嘔吐、肝腎損害、神經(jīng)毒性、骨髓抑制等毒副作用［6］?；熤聬盒膰I吐（chemotherapy-induced nausea and vomiting，CINV）是常見的早期化療毒性反應(yīng)［7-8］，削弱患者對化療藥物的耐受性，限制了化療臨床應(yīng)用。但不同人群發(fā)生CINV也各不相同，顯示了藥物反應(yīng)的遺傳易感性在CINV中起到關(guān)鍵作用。但目前尚缺乏中國人群結(jié)直腸癌CINV的藥物遺傳易感性研究；并且國外關(guān)于CINV遺傳易感性報(bào)道僅限于化療藥物代謝過程的相關(guān)基因，而藥物反應(yīng)的差異涉及到轉(zhuǎn)運(yùn)、分布、代謝、轉(zhuǎn)化各個(gè)環(huán)節(jié)，僅代謝過程相關(guān)基因遺傳變異不足以完全解釋結(jié)直腸癌CINV個(gè)體化差異。目前認(rèn)為惡心嘔吐反應(yīng)與5-羥色胺有關(guān)，而 5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（serotonin transporter，SERT）可將相應(yīng)部位的5-羥色胺迅速攝取從而終止其作用，但是目前SERT引起結(jié)直腸癌CINV的藥物基因組學(xué)研究尚未見報(bào)道。筆者進(jìn)一步檢索 Genbank數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），發(fā)現(xiàn)SERT啟動子區(qū)存在單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs956304A→G變異，并通過啟動子檢索工具TFSEARCH（http：//mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.ht mL）發(fā)現(xiàn)rs956304位點(diǎn)變異存在轉(zhuǎn)錄因子的改變。因此，本研究擬研究中國人群SERT啟動子位點(diǎn)rs956304A→G多態(tài)性與結(jié)直腸癌CINV的遺傳易感性，分析中國人群SERT啟動子多態(tài)位點(diǎn)與結(jié)直腸癌CINV的關(guān)聯(lián)，揭示中國結(jié)直腸癌人群CINV分子流行病學(xué)特征，為結(jié)直腸癌化療個(gè)體化用藥提供新的生物學(xué)標(biāo)記，為防治中國人群結(jié)直腸癌CINV提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胃腸外科2009年9月至2014年4月期間結(jié)直腸癌術(shù)后化療患者166例。所有入組病例均接受mFOLFOX6方案化療，并滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：（1）期望生存 ≥ 3個(gè)月；（2）心肺肝腎功能良好；（3）化療前血象、生化指標(biāo)基本正常；（4）化療前未經(jīng)相關(guān)放療及生物靶向治療；（5）細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)診斷為結(jié)直腸癌；（6）行手術(shù)切除并有術(shù)后病理診斷；（7）術(shù)后隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：未行手術(shù)者；無明確術(shù)后病理診斷者；術(shù)后未化療患者；肛管癌患者；家族性息肉病惡變患者。

1.2 結(jié)直腸癌CINV評估采用美國國立癌癥研究 所（National Cancer Institute，NCI）分 級 標(biāo) 準(zhǔn)（Common Ter minology Criteria for Adverse Events Version 4.0，CTCAE-4.0），見表1。統(tǒng)一培訓(xùn)調(diào)查員進(jìn)行評估。以0～1級結(jié)直腸癌CINV為參照（即無或輕度CINV），2～5級為中重度CINV。

表1 結(jié)直腸癌CINV不良反應(yīng)分級參考標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Reference standards of colorectal CINV grade

1.3 實(shí)驗(yàn)所用材料主要試劑：2xTaq PCR Green Mix（含有TaqDNA聚合酶，dNTPs，Taq酶反應(yīng)緩沖液、穩(wěn)定劑和染料）購買于北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司，引物由華大基因生物公司合成。上游引物：5′-AGGGGTCAGTTCCTCCAAGT-3′；下游引物：5′-AATTCCTCTCCGTCCCCAGA-3′，擴(kuò)增長度為662 bp。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法所有入組病例外周血標(biāo)本進(jìn)行以下操作：提取總DNA、PCR擴(kuò)增、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增產(chǎn)物測序。 具體如下：（1）模板DNA提?。焊嗡乜鼓艹槿⊥庵莒o脈血4 mL，用天根外周血DNA提取試劑盒提取白細(xì)胞總DNA，放-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?）PCR 擴(kuò)增目的基因：采用多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增目的DNA，PCR 反應(yīng)總體系20 μL，成份有10 μL 2×Taq PCR Green Mix（含有 0.1 U/μL Taq DNA polymerase，0.4 mmol/L dNTPs，2×反應(yīng)緩沖液、3 mmol/L MgCl2）、上游引物 2 μL（10 μmol/L），下游引物 2 μL（10 μmol/L），4 μL ddH2O，2 μL DNA模板。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，循環(huán)1次；95℃變性30 s，55℃變性30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；72℃最終延伸10 min，循環(huán)1次，4℃終延伸無窮大。PCR產(chǎn)物保存于-20℃。（3）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.7%瓊脂糖凝膠電泳，用DNA Maker DL1000作為參照物比對，恒壓90 V，時(shí)間45 min。將已跑完電泳的凝膠放入含有g(shù)el red染料的染液中染色30 min，接著置于熒光/可見光成像分析系統(tǒng)（BIO-RAD公司）下觀察，圖像分析可檢測到基因片段為662 bp。（4）基因型測序：將所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，測序結(jié)果與Pubmed查閱對應(yīng)的位點(diǎn)基因序列相一致。結(jié)果為rs956304基因多態(tài)性位點(diǎn)分析擴(kuò)增產(chǎn)物為3種基因型AA型（圖1）、AG型（圖2）、GG型（圖3）。圖中箭頭所指為多態(tài)性位點(diǎn)，雙峰為雜合子，單峰為純合子。

1.5 數(shù)據(jù)收集收集入組病例的性別、年齡、身高、體重、分化程度、分期、文化程度、腫瘤部位等臨床病理資料以及位點(diǎn)rs956304基因型。

1.6 數(shù)據(jù)處理采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用吻合度χ2檢驗(yàn)分析本研究人群rs956304基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg（H-W）遺傳平衡定律，吻合度用Arlequin3.0軟件處理。卡方檢驗(yàn)單因素分析臨床病理因素以及rs956304基因型與中到重度CINV的關(guān)聯(lián)。Logistic多因素風(fēng)險(xiǎn)模型分析各臨床病理因素及位點(diǎn)rs956304基因型對中到重度CINV的獨(dú)立影響。

圖1 rs956304 AA基因型Fig.1 rs956304 AA genotype

圖2 rs956304 AG基因型Fig.2 rs956304 AG genotype

圖3 rs956304 GG基因型Fig.3 rs956304 GG genotype

2 結(jié)果

2.1 研究對象的一般特征入選病例組有166例，其中男99例，女67例，年齡25～85歲，中位年齡為63歲，包括結(jié)腸癌92例（55.4%）、直腸癌74例（44.6%）。

2.2 遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)研究對象基因型符合H-W遺傳平衡定律（χ2=0.115 6336 8，P=0.733 82），說明樣本基因遺傳平衡，數(shù)據(jù)來自同一蒙德爾群體。

2.3 結(jié)直腸癌CINV關(guān)聯(lián)分析的單因素檢驗(yàn)單因素卡方檢驗(yàn)結(jié)果示中到重度CINV與性別、年齡、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、分化程度、分期、文化程度及腫瘤部位無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但中到重度CINV與位點(diǎn)rs956304基因型明顯相關(guān)，AG+GG基因型更易發(fā)生中到重度CINV（P=0.011）。見表2。

表2 結(jié)直腸癌患者CINV的單因素分析Tab.2 Univariate analysis of colorectal CINV 例（%）

2.4 Logistic多因素回歸分析進(jìn)一步把性別、年齡、BMI、分化程度、分期、文化程度、腫瘤部位及rs956304基因型納入Logistic回歸模型。結(jié)果顯示rs956304基因型依然與化療致惡心嘔吐相關(guān)，AG+GG型基因組患者相比AA型基因組的患者發(fā)生中到重度CINV的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高（OR=3.215，95%CI：1.202 ～ 8.599，P=0.020）。見表3。

表3 影響結(jié)直腸癌患者CINV的多因素回歸分析Tab.3 MultivariatelogisticregressionanalysisofcolorectalCINV

3 討論

化療是結(jié)直腸癌的重要治療手段，研究表明結(jié)直腸癌患者CINV的發(fā)生率為83.3%［9］，但臨床一般僅給予對癥處理，較少引起特別關(guān)注。本研究開創(chuàng)性地揭示了rs956304 AG+GG基因型患者更易發(fā)生中重度CINV，rs956304 AG+GG基因型是發(fā)生結(jié)直腸癌中重度CINV的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，首次揭示了SERT基因啟動子常見變異發(fā)生結(jié)直腸癌中重度CINV的遺傳易感性。

有研究［10］認(rèn)為引起CINV的主要機(jī)制可能與化療藥物刺激消化道黏膜的嗜鉻細(xì)胞釋放5-羥色胺有關(guān)，5-羥色胺與受體結(jié)合產(chǎn)生神經(jīng)沖動并傳入嘔吐中樞導(dǎo)致嘔吐［11-12］。5-羥色胺是一種與胃腸道活動關(guān)系密切的腦腸肽，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道的神經(jīng)遞質(zhì)，具有多種生物學(xué)功能［13-14］。5-羥色胺信號系統(tǒng)異?？蓪?dǎo)致胃腸動力及分泌功能異常、內(nèi)臟高敏感性等病理生理改變。在病理狀態(tài)下，5-羥色胺和其他炎癥因子一起，促進(jìn)腸道分泌及動力改變，引起惡心、嘔吐及疼痛等反應(yīng)［15］。5-羥色胺的再攝取由SERT跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)，該蛋白對5-羥色胺有高度親和力，它可將相應(yīng)部位的5-羥色胺迅速攝取從而終止其作用［16］。

由于SERT通過滅活5-羥色胺從而在結(jié)直腸癌CINV中有重要意義，而SERT啟動子轉(zhuǎn)錄活性決定了其表達(dá)水平［17］，因此研究SERT啟動子發(fā)生CINV的遺傳易感性也有重要意義。筆者也通過啟動子預(yù)測工具檢索發(fā)現(xiàn)，當(dāng)rs956304位點(diǎn)等位基因?yàn)橐吧虯時(shí)，可結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子A ML-1a、deltaE；rs956304位點(diǎn)等位基因?yàn)樽儺愋虶時(shí)，沒有轉(zhuǎn)錄因子。因此，由于rs956304單核苷酸多態(tài)性遺傳變異引起轉(zhuǎn)錄因子的改變，從而改變了SERT基因啟動子的活性，影響了SERT表達(dá)水平和5-羥色胺的再攝取，最終影響了結(jié)直腸癌CINV的易感性。

目前關(guān)于結(jié)直腸癌CINV的遺傳易感性亦有報(bào)道。楊牡丹等［18］研究了國內(nèi)159例結(jié)直腸癌患者，認(rèn)為XRCC1基因第399位密碼子多態(tài)性與結(jié)直腸癌CINV有關(guān)，發(fā)現(xiàn)XRCC1 AA或AG基因型的結(jié)直腸癌患者CINV的發(fā)生率明顯高于GG基因型。曹家燕等［19］研究了國內(nèi)212例頭頸部惡性腫瘤，結(jié)果212例患者化療后出現(xiàn)惡心嘔吐131例，出現(xiàn)惡心嘔吐與位點(diǎn)rs3758987有關(guān)，認(rèn)為HTR3B基因rs3758987位點(diǎn)與頭頸部惡性腫瘤患者化療后出現(xiàn)惡心嘔吐有關(guān)，發(fā)現(xiàn)CC、CT基因型者化療后出現(xiàn)惡心嘔吐的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于TT基因型者。但是，這些報(bào)道僅限于化療藥物代謝、轉(zhuǎn)化過程中的相關(guān)基因，對于直接作用于惡性嘔吐信號系統(tǒng)的基因尚未見報(bào)道。本研究首次報(bào)道作用于5-羥色胺的SERT基因遺傳易感性。

但是，本研究人群樣待證實(shí)。并且，本研究人群樣本例數(shù)雖然達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，但由于是單中心研本主要來自中國南方人群，中國其他地區(qū)人群、國外不同種族人群是否也有同樣的遺傳易感性尚有究，仍不免產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)偏倚，本研究結(jié)論尚需更大樣本量、多中心研究證實(shí)。

總之，本研究首次揭示了中國南方人群SERT啟動子位點(diǎn)rs956304 AG+GG基因型發(fā)生結(jié)直腸癌CINV的遺傳易感性，為防治中國南方人群結(jié)直腸癌CINV提供新的生物標(biāo)記，為結(jié)直腸癌化療個(gè)體化合理用藥提供了理論依據(jù)。

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