細(xì)菌脂多糖及高遷移率族蛋白1對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞M1/M2極化分型的影響

黃翔雨申曉青ZHOU Zheng 徐平平

1南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院（廣州 510280）；2南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院口腔科（廣州 510280）；3底特律大學(xué)牙學(xué)院（底特律 48208）

牙周炎和種植體周圍炎都是以牙齦組織炎癥及牙槽骨破壞吸收，導(dǎo)致牙齒或者種植體松動(dòng)為主要臨床表現(xiàn)的疾病。巨噬細(xì)胞作為主要的效應(yīng)細(xì)胞參與到此病理過(guò)程中，在牙周致病菌脂多糖（LPS）等刺激下釋放細(xì)胞因子，行使吞噬功能，引起骨吸收破壞。最近研究發(fā)現(xiàn)［1］LPS可激活巨噬細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)分子誘導(dǎo)高遷移率族蛋白1（HMGB1）的合成、轉(zhuǎn)位和釋放表達(dá)，提示HMGB1處于LPS作用的下游，但HMGB1在LPS引起巨噬細(xì)胞炎癥和破骨效應(yīng)中的作用和地位尚不清楚。本研究旨在探討HMGB1作為L(zhǎng)PS信號(hào)通路的下游，在巨噬細(xì)胞相關(guān)的炎癥和破骨效應(yīng)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑胎牛血清（Amizona Scientific LLC，美國(guó)）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；LPS（Sigma，美國(guó)）；HMGB1（R&D Systems，美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中。置于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中貼壁生長(zhǎng)。每2～3天更換培養(yǎng)液。待RAW264.7生長(zhǎng)至80%時(shí)，分別用HMGB1 1 μg/mL和LPS 1 μg/mL刺激18 h，陰性對(duì)照以DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q-PCR）刺激后細(xì)胞用PBS洗3次，用Trizol（invitrogen）提取總RNA，檢測(cè)濃度。取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成20 μL cDNA（Bio-Red），用10 μL體系，在Q-PCR儀器中擴(kuò)增檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞極化基因。M1型巨噬細(xì)胞極化基因：一氧化氮合酶2（NOS2）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）；M2型巨噬細(xì)胞極化基因：精氨酸酶1（ARG-1）、抵抗素樣分子α（RELM-α）的表達(dá)情況。GAPDH作為內(nèi)參基因，Cq值用2-△△Ct公式求出倍數(shù)變化值。實(shí)驗(yàn)所用的引物見(jiàn)表1。

表1 Q-PCR相關(guān)引物Tab.1 Q-PCR Primer sequences

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間均值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS刺激下RAW264.7相關(guān)極化基因表達(dá)情況巨噬細(xì)胞中加入1 μg/mL LPS刺激18 h，與空白對(duì)照相比，M1相關(guān)指標(biāo)：NOS2、IL-6、TNF-α相對(duì)基因表達(dá)量較對(duì)照組明顯上調(diào)（P＜0.01）。M2相關(guān)指標(biāo)：ARG-1、RELM-α相對(duì)基因表達(dá)量較對(duì)照組下調(diào)（P＞0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

表2 LPS實(shí)驗(yàn)組M1/M2型巨噬細(xì)胞極化基因相對(duì)表達(dá)量Tab.2 The relative expression level of macrophage in LPS group ±s

2.2 HMGB1刺激下RAW264.7相關(guān)極化基因表達(dá)情況HMGB1刺激過(guò)后的巨噬細(xì)胞，M1及M2的相對(duì)基因表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)。其中NOS2、TNF-α、RELM-α相對(duì)基因表達(dá)量較對(duì)照組明顯上調(diào)（P＜0.01）。見(jiàn)表3、圖2。

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞是功能上異質(zhì)的一種細(xì)胞群體，在不同的微環(huán)境刺激下形成不同的亞類［2］。根據(jù)細(xì)胞表型、分泌的細(xì)胞因子及其功能可為兩種亞類：M1型巨噬細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞［3］。M1型巨噬細(xì)胞通過(guò)“經(jīng)典途徑”，由Th1細(xì)胞因子活化［4］，分泌NOS、TNF-α、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子發(fā)揮宿主防御免疫功能，介導(dǎo)殺菌、促炎的作用［5］，與骨破壞有密切關(guān)系［6］。M2型巨噬細(xì)胞通過(guò)“替代途徑”，由Th2細(xì)胞因子活化［4］，分泌IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子，促進(jìn)組織再生穩(wěn)定，尤其在炎癥反應(yīng)后期發(fā)揮抗炎作用［7-8］，促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)和纖維變性［9］和骨重建［6］。巨噬細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)炎癥的始發(fā)，激活由淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)，分化為破骨細(xì)胞促進(jìn)牙槽骨吸收［10-11］等，參與到在牙周炎的病理過(guò)程中［12］。巨噬細(xì)胞M1/M2分型比例失調(diào)，M1比例增加，M2比例減少，牙周炎進(jìn)展破壞加??；反之牙周炎進(jìn)入穩(wěn)定修復(fù)期。

HMGB1是一種非組核蛋白。當(dāng)主動(dòng)分泌或被動(dòng)釋放到細(xì)胞外環(huán)境時(shí)，HMGB1可充當(dāng)細(xì)胞因子，因此在炎性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著多重作用，并介導(dǎo)從炎癥和細(xì)菌殺傷到組織修復(fù)的免疫應(yīng)答［13］。

牙周炎患者的齦溝液中HMGB1蛋白的表達(dá)量相對(duì)于正常組有顯著上調(diào)［14］，提示其與牙周炎的發(fā)生發(fā)展可能存在密不可分的聯(lián)系。LPS可以激活巨噬細(xì)胞分泌HMGB1［15-16］。LPS通過(guò)依次激活巨噬細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子P38、MAPK、NF-κB及CBP來(lái)誘導(dǎo)HMGB1的合成、轉(zhuǎn)位和釋放表達(dá)［17］。其釋放及起效較其他促炎分子晚［18］。以上發(fā)現(xiàn)均提示，HMGB1處于LPS的下游，并可作為L(zhǎng)PS的延遲介質(zhì)起作用［18］，可能是LPS誘發(fā)的牙周炎的信號(hào)通路上關(guān)鍵的一環(huán)。

本研究對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7進(jìn)行LPS、HMGB1刺激后，檢測(cè)M1和M2方向相關(guān)基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LPS的刺激使小鼠巨噬細(xì)胞基因水平表達(dá)M1型增加、M2型減少，M1/M2的比例上調(diào)。這與以往研究一致。在HMGB1的刺激下，同樣發(fā)現(xiàn)RAW264.7細(xì)胞向M1方向極化顯著增加。上述結(jié)果說(shuō)明，HMGB1作為L(zhǎng)PS的下游因子，LPS可通過(guò)HMGB1促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1極化，引起促炎因子IL-6、TNF-α等的釋放，加重局部組織炎性反應(yīng)；同時(shí)介導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，激活破骨細(xì)胞活性，從而加速了牙周炎患者的牙齦炎癥和骨吸收破壞。

圖1 LPS對(duì)M1/M2型巨噬細(xì)胞極化基因表達(dá)的影響Fig.1 The effect of LPS on M1/M2 macrophage related mRNA expression

圖2 HMGB1對(duì)M1/M2型巨噬細(xì)胞極化基因表達(dá)的影響Fig.2 The effect of HMGB1 on M1/M2 macrophage related mRNA expression

表3 HMGB1實(shí)驗(yàn)組M1/M2型巨噬細(xì)胞極化基因相對(duì)表達(dá)量Tab.3 The relative expression level of macrophage in HMGB1 group ±s

表3 HMGB1實(shí)驗(yàn)組M1/M2型巨噬細(xì)胞極化基因相對(duì)表達(dá)量Tab.3 The relative expression level of macrophage in HMGB1 group ±s

另外本研究還發(fā)現(xiàn)，HMGB1刺激后，巨噬細(xì)胞M2分化的標(biāo)志性分子表達(dá)顯著上調(diào)，提示HMGB1還有促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2分化的作用，HMGB1作為L(zhǎng)PS的下游因子，在LPS引起的牙周炎這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中除了扮演已知的“破壞者”的角色，還可能有“剎車”的作用——可以啟動(dòng)修復(fù)反應(yīng)，避免機(jī)體組織受到無(wú)限制的破壞，從而調(diào)控組織破壞的程度，維持組織的穩(wěn)態(tài)。但該功能何時(shí)啟動(dòng)、如何啟動(dòng)？對(duì)牙周炎和種植體周圍炎的防治有無(wú)啟示作用？這些均值得下一步深入研究。近年也有研究發(fā)現(xiàn)HMGB1與M2型巨噬細(xì)胞存在一些關(guān)聯(lián)［20-21］，HMGB1可以通過(guò)RAGE增強(qiáng)M2型巨噬的細(xì)胞的活性［22］。但未有研究闡明作為下游分子的HMGB1在LPS通路中對(duì)巨噬細(xì)胞分化所起的“雙向調(diào)節(jié)”作用。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)HMGB1除了可促進(jìn)巨噬細(xì)胞往M1型極化，加重組織損傷以外，還能促進(jìn)巨噬細(xì)胞往M2型極化，阻止炎癥破壞進(jìn)一步惡化，促進(jìn)組織再生修復(fù)。通過(guò)研究并干預(yù)增強(qiáng)此過(guò)程的信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)牙周炎癥破壞后的組織重建，有望為牙周炎和種植體周圍炎的治療提供新的參考思路。

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