峨眉山區(qū)?？扑幱弥参颕TS2條形碼序列鑒定＊

任瑤瑤，張 良，謝博文，江南屏，劉睿穎，譚 睿

（西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 成都 610031）

峨眉山位于四川盆地邊緣亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，峨眉山最高海拔為3 099 m，山頂山麓相對高差近2 600 m，氣候懸殊，山頂和山麓溫差大，氣溫垂直變化顯著，因而其植被分布具有明顯的垂直分布性，加之峨眉山區(qū)降雨量豐富，空氣相對濕度達(dá)80%以上，使得該區(qū)域植物資源極為豐富，多種自然要素的交匯，形成了峨眉山豐富的植物種類和復(fù)雜的區(qū)系成分[1，2]。

?？疲∕oraceae）植物約有53屬1 400種，多產(chǎn)于熱帶、亞熱帶，少數(shù)分布在溫帶地區(qū)。我國約有12屬153種和亞種，并有變種及變型59個[3]。?？浦参镏芯哂兴幱脙r值的?？浦参锛s55種，在我國國民經(jīng)濟(jì)中具有重大意義[4]。構(gòu)屬（Broussonetia）藥用植物具有增強(qiáng)免疫[5]、消除自由基[6]、降血脂等作用[7]；桑屬（Morus）植物降血糖作用[8]、降壓降血脂作用、抗氧化作用[9]抗菌和抗病原微生物作用[10]；榕屬（Ficus Linn）植物有降血糖[11]、鎮(zhèn)痛抗炎[12]、抗菌[13,14]、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的作用。峨眉山有豐富的?？扑幱觅Y源，?？浦性S多的用植物具有藥食兩用價值，峨眉山常見的?？扑幱弥参镉猩＃∕orus alba）、地果（Ficus tikoua）、黃葛樹（Ficus virens）、冠毛榕（Ficus gasparriniana）、異葉榕（Ficus heteromorpha）、葎草（Humulus scandens）、小構(gòu)樹（Broussonetia kazinoki）、構(gòu)樹（Broussonetia papyrifera）等，且分布廣泛，資源較為豐富。

運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)對藥用植物進(jìn)行鑒定是現(xiàn)在中藥鑒定研究的熱點[15]。陳士林等[16]首次提出將ITS2序列作為藥用植物鑒定的通用條形碼序列。本實驗采集了峨眉山區(qū)不同地區(qū)的?？浦参飿颖荆腉enbank下載同科或同屬ITS2序列，以ITS2序列作為DNA條形碼，對所有序列進(jìn)行遺傳距離、barcoding gap、Neighbor Joining（NJ）系統(tǒng)進(jìn)化樹和ITS2序列二級結(jié)構(gòu)分析，對桑科藥用植物進(jìn)行鑒定。通過DNA條形碼技術(shù)對?？浦参锏姆诸愡M(jìn)行研究，對具有藥用價值的桑科植物的研究提供基礎(chǔ)，同時也為進(jìn)一步對峨眉山藥用植物資源的分布環(huán)境、種群量、種群動態(tài)等方面的調(diào)查分析奠定基礎(chǔ)。

表1 桑科植物樣本信息

1 材料

從四川省峨眉山區(qū)采集了25份?？浦参飿颖?，經(jīng)西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院宋良科副教授鑒定，其中桑樣品6份、地果樣品3份、冠毛榕樣品4份、異葉榕4份樣品、葎草樣品2份、小構(gòu)樹樣品3份、構(gòu)樹樣品3份樣品信息見表1。標(biāo)本保存于西南交通大學(xué)標(biāo)本室。同時在GenBank數(shù)據(jù)庫中下載?？浦参颕TS2序列23條，見表2。

2 方法

2.1 樣品DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序

參照任瑤瑤等[18]文章中樣品DNA提取、測序等方法，對所采集的樣本進(jìn)行基因組DNA提取、ITS2片段PCR擴(kuò)增及測序。

表2 GenBank下載?？浦参颕TS2序列

2.2 數(shù)據(jù)處理

圖1 桑科植物樣本種間和種內(nèi)距離

圖2 ?？扑幱弥参飿颖綢TS2序列種內(nèi)和種間變異分布

采用CodonCode Aligner 6.0.2軟件對所得序列峰圖進(jìn)行校對拼接，去除引物區(qū)和低質(zhì)量的序列，由基于隱馬爾可夫模型（HMMer）的注釋方法切除ITS2兩端的5.8 S和28 S區(qū)域，獲得標(biāo)準(zhǔn)的ITS2間隔區(qū)序列[19]。所有ITS2序列用MEGA 6.0比對[20]進(jìn)行種內(nèi)、種間的遺傳變異分析[21]、計算K2P（Kimura 2-parameter）遺傳距離、相鄰結(jié)合法（Neighbor Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[22]，利用Booststrap（1000重復(fù)）檢驗各分支的支持率。利用TAXON DNA 1.8和DNAMAN 8.0軟件對所有樣本種內(nèi)、種間遺傳距離進(jìn)行分布頻度及樣本序列的變異程度進(jìn)行分析，評價Barcoding gap。根據(jù)Koetschan等[23]建立的ITS2數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（http://its2.bioapps.biozentrum.uniwuerzburg.de）預(yù)測不同種屬樣本ITS2序列的二級結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果

3.1 變異位點及種內(nèi)、種間K2P遺傳距離分析

所有ITS2序列長度為234-254 bp、GC含量58%-72%（見表1）。應(yīng)用MEGA6.0軟件對所有樣品及下載序列進(jìn)行多序列比對，全序列排序比對后序列長度為274 bp，種內(nèi)變異位點少，種間變異位點多，其中變異位點有185個，簡約性信息位點166個，分別占總序列長度的67.52%和60.58%。

物種間種內(nèi)距離越小、種間距離越大越適合條形碼鑒定[18]。參照陳士林等方法[16]，應(yīng)用MEGA 6.0軟件基于K2P距離模型計算樣本種內(nèi)、種間變異距離值，結(jié)果見圖1。DNAMAN軟件對比序列發(fā)現(xiàn)：M.mongolica與M.alba種類序列相似度為100%，種間序列相似度為99.89%，兩者種間遺傳變異較??；而F.tikoua種內(nèi)序列相似度為99.50%，其種內(nèi)變異程度（K2P 0.012）大于M.mongolica與M.alba種間變異程度（K2P 0.005）。此外所有樣本種內(nèi)最大變異值為0.0049，所有樣本種間最小遺傳距離為0.041；由熱圖可見本實驗中?？茦悠贩N內(nèi)、屬內(nèi)顏色淺，其K2P遺傳距離較?。桓鲗僦g遺傳距離較大，為圖中顏色較深區(qū)域；葎草屬與其他屬樣本種間遺傳變異值較大，在熱圖中所對應(yīng)的區(qū)域顏色最深。分析統(tǒng)計樣本種內(nèi)和種間遺傳距離分布（圖2）發(fā)現(xiàn)：樣本間存在較為明顯的barcoding gap，說明ITS 2序列對?？茦颖驹诜N水平上鑒定能力較強(qiáng)；種間變異距離值主要集中在0.300-0.600區(qū)間，主要是構(gòu)屬、葎草屬、榕屬之間的遺傳變異距離值組成。

3.2 NJ樹分析

利用MEGA 6.0軟件根據(jù)Kimura 2-parameter model對所有ITS2序列樣本構(gòu)建Neighbor-joining（NJ）系統(tǒng)聚類樹（圖3），從NJ進(jìn)化樹圖可以看出，各樣本屬內(nèi)各單據(jù)一支，分別為榕屬、桑屬、構(gòu)屬、葎草屬，分支之間靴帶檢驗法（bootstrap）支持率在90%以上；各屬內(nèi)種內(nèi)之間又各聚為小枝，支持率在85%以上；由NJ進(jìn)化樹可見，ITS2序列能將?？茦颖驹诜N水平上很好地分開，鑒定成功率為100%。

3.3 ITS2二級結(jié)構(gòu)的分析

?？浦参飿颖綢TS2序列的二級結(jié)構(gòu)如圖4所示，從樣本的二級結(jié)構(gòu)中可以看出，ITS2二級結(jié)構(gòu)相互之間均有差異，其均為一個中心環(huán)及4個螺旋區(qū)（Helix）組成，中心環(huán)大小、形狀形成差異，在螺旋區(qū)莖環(huán)（Loop）數(shù)量、形狀及大小形成差異，四個螺旋區(qū)的夾角也有明顯差異。F.pumila、H.scandens、M.alba、B.papyrifera的中心環(huán)為異形，四者二級結(jié)構(gòu)主要差異在于Ⅱ螺旋區(qū)莖環(huán)的大小數(shù)量差異。因此通過ITS2二級結(jié)構(gòu)可將桑科樣本中各個種較為直觀地鑒別開來。

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的?？浦参飿颖镜腘J樹

4 結(jié)論

DNA條形碼技術(shù)旨在建立一種準(zhǔn)確、方便、快捷且對技術(shù)要求不高的一種生物分類鑒定方法，ITS2序列對植物具有良好的擴(kuò)增成功率和物種水平的鑒定成功率[24,25]，以ITS2序列作為DNA條形碼對桑科植物的鑒定進(jìn)行研究可以達(dá)到即快速又準(zhǔn)確。本研究將峨眉山區(qū)不同地方的25份桑科植物樣本的ITS2序列分析，桑科樣本ITS2序列變異位點和簡約性信息位點在全序列中占比67.52%和60.58%，說明ITS2序列中存在大量的物種分類及進(jìn)化信息，在對K2P遺傳距離分析通過桑科植物樣本種間和種內(nèi)距離的熱圖可以看出種內(nèi)顏色較淺、屬內(nèi)顏色次之，種內(nèi)和種間變異分布有明顯的barcoding gap，NJ樹可以看出?？撇煌瑢儆H緣關(guān)系較遠(yuǎn)各聚一大支，而同屬之間親緣關(guān)系比較近，但是不同種也很明顯的各聚一小支。綜合所有樣本ITS2序列種內(nèi)、種間的變異距離值、barcoding gap分析、NJ樹構(gòu)建及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測等多種方法從不同方面對考察了ITS2條形碼序列對?？浦参镨b定能力，結(jié)果均表明，以ITS2序列為DNA條形碼對桑科藥用植物種水平上的鑒定能力強(qiáng)。

圖4 ?？艻TS2序列的二級結(jié)構(gòu)

峨眉山資源植物品類齊全，尤其是在藥用、食用等方面的植物資源最為豐富多樣，是我國資源植物的重要野外基因庫，為當(dāng)?shù)氐纳鐣c經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供了獨特的、重要的支撐[26]。利用DNA條形碼技術(shù)，對資源植物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定，對峨眉山地區(qū)藥用植物資源進(jìn)行廣泛地調(diào)查和分析，并對其進(jìn)行認(rèn)識、保護(hù)和合理開發(fā)利用。藥用植物資源的鑒定工作固然重要，但資源管理也相當(dāng)重要，將二維DNA條形碼應(yīng)用于中藥材鑒定，對中藥材流通的數(shù)字化監(jiān)管[27]的思路可借鑒到對藥用資源的調(diào)查中，結(jié)合分布環(huán)境，弄清種群量和種群動態(tài)等問題，正確的評價資源植物當(dāng)前的狀況，在此基礎(chǔ)上制訂出切合實際的保護(hù)及合理開發(fā)利用的措施。

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