膠原誘導類風濕關節(jié)炎小鼠的重要臟器病理變化＊

郭晴晴，鄭 康，趙雨坤，劉 學，邱雪梅，樊丹平，呂愛平，何小鵑＊＊

（1.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)臨床基礎醫(yī)學研究所 北京 100700；2.西南交通大學生命科學與工程學院 成都 610031；3.香港浸會大學中醫(yī)藥學院 香港 999077）

類風濕關節(jié)炎是一種慢性、系統(tǒng)性的自身免疫疾病，特征為多關節(jié)、對稱性、侵襲性關節(jié)炎癥，多發(fā)于手、足小關節(jié)，常伴有關節(jié)外器官受累[1,2]。類風濕關節(jié)炎病人關節(jié)的主要病理特征表現(xiàn)為滑膜增生、關節(jié)腔變小、炎細胞浸潤、血管翳形成、關節(jié)軟骨及軟骨下骨的破壞等[3,4]。除了關節(jié)的病理變化，還會出現(xiàn)多種關節(jié)外病變，例如心臟病變、肺部病變、腎臟損害等[5]。類風濕關節(jié)炎的關節(jié)病變一般只能致殘，致死罕見，但是關節(jié)外的損害有致死的可能。因此，全面了解類風濕關節(jié)炎的關節(jié)外表現(xiàn)有利于我們對類風濕關節(jié)炎全貌的認識，有利于避免誤診，早期治療，改善預后。

多種類風濕關節(jié)炎動物模型的建立促進了我們對類風濕關節(jié)炎發(fā)病機制及病理變化的研究和認識，特別是對關節(jié)病理的研究，但是利用動物模型研究類風濕關節(jié)炎關節(jié)外病變的較少。小鼠膠原誘導關節(jié)炎模型在臨床表現(xiàn)和病理機制等方面與人的類風濕關節(jié)炎有很多相似之處，是研究類風濕關節(jié)炎病理機制的較理想模型[6]。因此，我們采用牛II型膠原混合完全弗氏佐劑誘導DBA/1小鼠，觀察小鼠各個重要臟器的病理變化，以期觀察該模型是否可用于類風濕關節(jié)炎關節(jié)外病變的研究。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

20只DBA/1小鼠，雄性，7-8周，18-22 g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2012-0001，在恒溫（24±2）℃、光照周期12 h環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑：完全弗氏佐劑（Chondrex，Lot：150034）、牛II型膠原（Chondrex，Lot∶140519）、Mayer蘇木素染色液（LEAGENE，Lot∶0911A15）、伊紅染色液（LEAGENE，Lot∶0810A15）、UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（生工生物工程股份有限公司，Lot∶CA04KA4108）、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)（Takara，Lot∶AK3401）、SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)（Takara，Lot∶AK7103）。

主要儀器：小型高速離心機（eppendorf，型號：Cen?trifuge 5430）、渦旋振蕩儀（其林貝爾儀器制造有限公司，型號：QL-902）、熒光定量PCR儀（Applied Biosys?tems，型號：ABI7500）、包埋機（Thermo Scientific，型號：Shandon Histocentre 3）、切片機（Thermo Scientific，型號：Shandon Finesse ME+）、展片機（Thermo Scientific，型號：Tissue Flotation Bath）、烤片機（Thermo Scientific，型號：Hotplate）、正置生物顯微鏡（LEICA，型號：DM6000B）、微量紫外分光光度計（Thermo Scientific，型號：Nanodrop 2000）。

1.3 引物合成及序列

TGF-β1、TNF-α及內參基因GAPDH的上下游引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成。TGF-β1 上游引物：5′-ATTGGCCAGCATCCATCTCTTG-3′，下游引物：5′-TGCCACCATCATAGACTAG?ATTC-3′；TNF-α上游引物：5′-AGGCACTCCCCCAA AAGAT-3′，下游引物：5′-CAGTAGACAGAAGAGCGT?GGTG-3′；GAPDH上游引物：5′-AGGCCGGTGCTGAG?TATGTC-3′，下游引物：5′-TGCCTGCTTCACCACCTT CT-3′。

2 實驗方法

2.1 小鼠膠原誘導關節(jié)炎模型的制備

將DBA/1小鼠隨機分成2組，分別為正常對照組和模型組，每組10只。模型組小鼠按以下方法造模：濃度為2 mg·mL-1的牛Ⅱ型膠原溶液和完全弗氏佐劑以1∶1（體積比）的比例混合，將牛Ⅱ型膠原逐滴加入完全弗氏佐劑中，整個過程在冰浴中進行，邊滴邊用勻漿器乳化，每轉3 min，停止1 min，直至將乳化劑滴至水中，若不擴散說明已充分乳化。乳化劑需現(xiàn)用現(xiàn)配，Day 0于尾根部皮內注射，100 μL/只，Day 21用同樣的方法加強免疫[7]。

2.2 關節(jié)炎評分

造模后每周進行一次關節(jié)炎評分，評分標準如下：0分=無紅腫；1分=小趾關節(jié)紅腫；2分=趾關節(jié)和小趾關節(jié)腫脹；3分=踝關節(jié)以下部位腫脹；4分=整個足爪腫脹（包含踝關節(jié)）。每次記錄小鼠四肢的評分，累計最高評分為16分[8]。

2.3 病理學觀察

于Day63處死小鼠，分離心、肝、脾、肺、腎和踝關節(jié)。將臟器置于10%福爾馬林緩沖液中固定，將踝關節(jié)剔除周圍軟組織后置于4%多聚甲醛中固定。踝關節(jié)固定48 h后，置于10%EDTA脫鈣液中脫鈣，以1 mL注射器針頭能刺入關節(jié)骨內為脫鈣完全。將脫鈣好的踝關節(jié)用不同濃度的梯度乙醇脫水，二甲苯中透明，石蠟包埋，制作病理切片（4 μm），經蘇木素-伊紅（HE）染色后，顯微鏡下觀察各組織病理學變化。

2.4 Real-time PCR檢測小鼠肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA水平

按照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒的說明書提取小鼠肺總RNA，使用Nanodrop 2000測量RNA的純度和濃度。按照Prime Script?RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒中的說明書將RNA反轉錄成cDNA。Real-time PCR按照SYBR?Premix Ex Taq?II(Tli RNase H Plus)試劑盒中的說明書進行操作，擴增程序為：95℃ 30 sec，（95℃ 5 sec，60℃ 40 sec）×45個循環(huán)，95℃15 sec，60℃1 min，95℃15 sec。采用2-△△CT法計算目的基因mRNA的相對表達量。

3 結果

3.1 CIA小鼠體征觀察情況

DBA/1小鼠造模成功后，毛發(fā)逐漸失去光澤，前肢、后肢陸續(xù)出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象，功能障礙，活動減少，體重下降，Day42-63為腫脹高峰期，發(fā)病率達100%。圖1為正常小鼠和CIA發(fā)病小鼠的關節(jié)比較圖。

3.2 CIA小鼠關節(jié)炎評分結果

CIA小鼠的關節(jié)炎評分見圖2，分析可知，小鼠于Day28左右開始發(fā)病，然后關節(jié)炎評分逐漸增高，Day42-63為疾病高峰期，最高評分可達12分。

3.3 CIA小鼠踝關節(jié)和心、肝、脾、肺、腎的組織病理變化

3.3.1 踝關節(jié)病理表現(xiàn)

圖1 正常小鼠和CIA發(fā)病小鼠的關節(jié)比較圖

圖2 CIA小鼠關節(jié)炎評分

正常小鼠和CIA小鼠的踝關節(jié)HE染色病理圖見圖3，結果顯示：正常小鼠的踝關節(jié)結構完整，關節(jié)腔內干凈，關節(jié)表面光滑平整，滑膜細胞1-2層，排列整齊，軟骨和骨非常完整。CIA小鼠的踝關節(jié)可見滑膜增生，關節(jié)間隙明顯變窄，有關節(jié)腔積液，大量的炎細胞浸潤，血管翳形成，軟骨和軟骨下骨均有侵蝕現(xiàn)象。

3.3.2 心臟病理學表現(xiàn)

正常小鼠和CIA小鼠的心臟HE染色病理圖見圖4，結果顯示：正常小鼠的心肌組織結構清晰，心肌纖維細長，呈圓柱形，心肌纖維間有少量的結締組織。CIA小鼠的心臟病理結果和正常小鼠的相似，沒有出現(xiàn)明顯的病理變化。

3.3.3 肝臟病理學表現(xiàn)

正常小鼠和CIA小鼠的肝臟HE染色病理圖見圖5，結果顯示：正常小鼠的肝小葉結構清晰完整，肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，形態(tài)結構正常。CIA小鼠的肝臟未出現(xiàn)異?，F(xiàn)象。

3.3.4 脾臟病理學表現(xiàn)

正常小鼠和CIA小鼠的脾臟HE染色病理圖見圖6，結果表明：正常小鼠的脾臟結構特征清晰完整，白髓和紅髓的界限比較明顯，能清楚的看到淋巴小結中央動脈以及動脈周圍的淋巴鞘，淋巴細胞密集。CIA小鼠的脾臟沒有發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化。

3.3.5 肺臟病理學表現(xiàn)

正常小鼠和CIA小鼠的肺臟HE染色病理圖見圖7，結果顯示：正常小鼠的肺組織中肺泡的結構完整清晰，肺泡腔和支氣管腔非常干凈，有少量的紅細胞。CIA小鼠的肺部有大量的炎性細胞浸潤，肺泡間隔增厚，肺泡腔中有炎性浸出物，部分肺泡變小。

圖3 小鼠踝關節(jié)的HE染色圖（×200）

圖4 小鼠心臟的HE染色圖（×200）

圖5 小鼠肝臟的HE染色圖（×400）

圖6 小鼠脾臟的HE染色圖（×400）

圖7 小鼠肺臟的HE染色圖（×200）

3.3.6 腎臟病理學表現(xiàn)

圖8 小鼠腎臟的HE染色圖（×400）

圖9 小鼠肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA表達水平

正常小鼠和CIA小鼠的腎臟HE染色病理圖見圖8，結果顯示：正常小鼠的腎臟結構正常，有皮質和髓質之分，可見大量的泌尿小管，以及由少量結締組織、血管、神經等構成的腎間質，腎小管上皮細胞完好。CIA小鼠的腎臟未見明顯的病理變化。

3.4 小鼠肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA表達水平

由圖9可知，模型組小鼠肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA水平明顯高于正常組小鼠的肺組織（P＜0.01）。

4 討論

類風濕關節(jié)炎作為以滑膜炎和關節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性疾病，經常伴有一些關節(jié)外損害[9]。本文采用牛II型膠原混合完全弗氏佐劑誘導DBA/1小鼠，成功建立了小鼠CIA模型，并觀察小鼠各個重要臟器的病理變化，以期觀察該模型是否存在關節(jié)外的并發(fā)癥。研究發(fā)現(xiàn)，造模成功的DBA/1小鼠除肺部有明顯病變外，肝、心、脾、腎未出現(xiàn)明顯的病理變化。

據臨床觀察及文獻報道，肺臟是RA患者除關節(jié)外最易受累的器官，這與肺內部豐富的結締組織及血液供應有很大關系。RA的肺部并發(fā)癥包括肺間質病變、細支氣管炎、慢性支氣管擴張、胸腔積液、類風濕結節(jié)等[1]。RA并發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病在RA患者死因中位居第二位，且近年來其死亡率呈明顯上升趨勢，其中由于類風濕關節(jié)炎間質性肺?。≧A-ILD）引起的肺泡炎性肺纖維化是其死亡的直接或間接原因[10]。RA-ILD的高死亡率是由于肺部病變早期癥狀不明顯易被忽略，晚期出現(xiàn)癥狀后預后差[11]。因此早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療RA合并肺部并發(fā)癥有重要意義。

間質性肺病早期肺實質細胞發(fā)生急性肺泡炎，炎癥和免疫效應細胞不斷增生、募集與活化，隨著病情發(fā)展，肺泡結構破壞，間質膠原紊亂，大量纖維組織增生，肺泡隔被破壞，形成囊性化，病變不可逆[12]。我們的研究發(fā)現(xiàn)CIA小鼠的肺部出現(xiàn)明顯的炎性病變，肺間質內有大量的炎細胞浸潤，肺泡間隔增厚，肺泡腔中有炎性浸出物，這與RA肺部并發(fā)癥的病理變化有相似之處。

RA-ILD的發(fā)病機制可能與細胞、細胞因子以及細胞外基質等因素的相互作用有關，過程復雜，仍有待進一步闡明[13]。據報道，肺富含TGF-β，誘導TGF-β活性高表達是肺間質纖維化進程啟動的重要因素之一[14,15]。此外，TNF-α等細胞因子可刺激肺內皮細胞和白細胞釋放炎性介質，進而損傷肺組織，形成肺間質纖維化[16,17]。本研究采用Real-time PCR法分別檢測病變的CIA小鼠肺組織和正常的肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)病變肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA水平顯著高于正常肺組織。

綜上所述，膠原誘導的DBA/1小鼠的肺部病變與RA肺部并發(fā)癥的病理變化及發(fā)病機制有相似之處，可以利用該模型進行RA肺部受累的研究，有利于通過動物模型進行深入的機制研究和藥效研究。

1 Gauhar U A,Gaffo A L,Alarcón G S.Pulmonary manifestations of rheu?matoid arthritis.Semin Respir Crit Care Med.2007,28(4):430-440.

2 Chen G,Lu C,Zha Q,et al.,A network-based analysis of traditional Chinese medicine cold and hot patterns in rheumatoid arthritis.Comple?ment Ther Med.2012,20(1-2):23-30.

3 Brzustewicz E,Bryl E.The role of cytokines in the pathogenesis of rheu?matoid arthritis-Practical and potential application of cytokines as bio?markers and targets of personalized therapy.Cytokine.2015,76(2):527-36.

4 趙建平,馮振宇,孟霜,等.風濕寧膠囊對類風濕關節(jié)炎大鼠Th17/Treg平衡和局部炎性因子的影響.世界科學技術-中醫(yī)藥現(xiàn)代化.2015,17(8):1656-1663.

5 縱瑞凱,劉健.類風濕關節(jié)炎關節(jié)外病變研究進展.中醫(yī)藥臨床雜志.2010,22(9):833-835.

6 周茹,楊以阜,左建平.Ⅱ型膠原誘導的小鼠關節(jié)炎動物模型的建立及影響因素.中國藥理學通報.2006,22(12):1532-1535.

7 Gonzalo-Gil E,Pérez-Lorenzo MJ,Galindo M,et al.Human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells ameliorate collagen-in?duced arthritis by inducing host-derived indoleamine 2,3 dioxygenase.Arthritis Res Ther.2016,18:77-86.

8 Bashi T,Shovman O,Fridkin M,et al.Novel therapeutic compound tuft?sin-phosphorylcholine attenuates collagen-induced arthritis.Clin Exp Immunol.2016,184(1):19-28.

9 Turesson C.Extra-articular rheumatoid arthritis.Curr Opin Rheumatol.2013,25(3):360-366.

10 Bongartz T,Nannini C,Medina-Velasquez Y F,et al.Incidence and mortality of interstitial lung disease in rheumatoid arthritis:a popula?tion-basedstudy.Arthritis Rheum.2010,62(6):1583-1591.

11 Yang J A,Lee J S,Park J K,et al.Clinical characteristics associated with occurrence and poor prognosis of interstitial lung disease in rheu?matoid arthritis.Korean J Intern Med.2017,28.doi:10.3904/kjim.2016.349.

12樊任珠.痹痛靈顆粒對膠原誘導關節(jié)炎關節(jié)滑膜及肺部病變血管新生影響的研究.南京:南京中醫(yī)藥大學.2011.

13 Cavagna L,Monti S,Grosso V,et al.The multifaceted aspects of intersti?tial lung disease in rheumatoid arthritis.Biomed Res Int.2013,2013：759-760.doi:10.1155/2013/759760.

14 Chu H,Shi Y,Jiang S,et al.Treatment effects of the traditional Chinese medicine Shenks in bleomycin-induced lung fibrosis through regulation of TGF-beta/Smad3 signaling and oxidative stress.Sci Rep.2017,7(1)：2252.

15 Luo Y,Xu W,Chen H,et al.A novel profibrotic mechanism mediated b TGFβ-stimulated collagen prolyl hydroxylase expression in fibrotic lung mesenchymal cells.J Pathol.2015,236(3):384-394.

16 Redente E F,Keith R C,Janssen W,et al.Tumor necrosis factor-αac?celerates the resolution of established pulmonary fibrosis in mice by tar?geting profibrotic lung macrophages.Am J Respir Cell Mol Biol.2014,50(4):825-837.

17 Colomb F,Krzewinski-Recchi M A,Steenackers A,et al.TNF up-regu?lates ST3GAL4 and sialyl-Lewisx expression in lung epithelial cells through an intronic ATF2-responsive element.Biochem J.2017,474(1):65-78.