濕熱環(huán)境對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠肝炎模型的影響及代謝組學(xué)研究＊

王 洋，蔡志鋼，張永煜

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)方證與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心 上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 上海 201203；3.麥特繪譜生物科技（上海）有限公司 上海 201203）

濕熱既是常見的致病因素，又是疾病過程中容易出現(xiàn)的特殊病理狀態(tài)，常使疾病纏綿難愈。濕熱證在一些疾病中分布突出，如肝炎[1]、關(guān)節(jié)炎[2]、原發(fā)性腎小球疾病[3]。隨著中醫(yī)癥候研究的深入，癥候動(dòng)物模型的復(fù)制成為中醫(yī)癥候研究的瓶頸之一。濕熱證的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化、客觀化的動(dòng)物模型研究將為濕熱證的證物質(zhì)內(nèi)涵研究奠定了良好的基礎(chǔ)[4]。目前為止，濕熱證動(dòng)物模型建立大都遵循模擬傳統(tǒng)病因“外濕引動(dòng)內(nèi)濕”的基本要求，一般采用“飲食+環(huán)境+致病因子”復(fù)合因素造模[5,6]。有研究對(duì)濕熱環(huán)境下正常飲食和高脂飲食的濕熱動(dòng)物模型進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)飲食對(duì)動(dòng)物模型的影響無顯著差異性[7]，本課題組在前期研究中采用“高糖高脂飲食+濕熱環(huán)境+酒精”復(fù)合因素進(jìn)行了模型篩選，根據(jù)臨床以及濕熱證動(dòng)物模型篩選研究結(jié)果提示濕熱環(huán)境對(duì)濕熱模型的影響可能更突出。因此，本研究考察濕熱環(huán)境對(duì)四氯化碳致大鼠慢性肝炎疾病的影響作用。通過一般體征指標(biāo)、生化指標(biāo)、病理切片、代謝組學(xué)四個(gè)方面探討濕熱環(huán)境對(duì)疾病的影響作用，并分析濕熱環(huán)境對(duì)疾病影響的物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

Wistar雄性大鼠24只，120-140 g，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（清潔級(jí)）。室內(nèi)溫度20-25℃，相對(duì)濕度為55-65%。購買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物合格證編號(hào)：2015000524543。

1.2 試劑

N-O-雙（三甲硅基）三氟乙酰胺（BSTFA，含1%TMCS，美國Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：33148），甲氧胺鹽酸鹽（美國Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：226904），十七酸（美國Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：H3500），甲醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：80080418），四氯化碳（批號(hào)：10006480），水合氯醛（批號(hào)：30037517），氯仿（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 儀器

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS，Agilent6890/5975B，Agilent科技有限公司），氣相毛細(xì)管色譜柱（DB-5 MS，Agilent科技有限公司），微型漩渦混合器（Vortex-Genie 2，美國 Scientific Industries，Inc），樣品濃縮儀（SBH 130D/3，英國Stuart公司），高速冷凍離心機(jī)（Centrifuge 5415R，德國Eppendorf公司），Milli-Q超純水系統(tǒng)（Milli-Q Gradient，Millipore中國有限公司），數(shù)控超聲儀（KQ-250DB型，昆山市超聲儀器有限公司），低溫冷凍冰箱（U9260-020，英國），人工氣候箱（上海三騰儀器有限公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及造模

Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周左右，體重達(dá)200 g左右后，進(jìn)行隨機(jī)分組。動(dòng)物分組：正常組、模型組一（單純CCl4，6周）、模型組二（CCl4+濕熱環(huán)境，6周）。模型組一和模型組二第一次以CCl4純?nèi)芤?ml/kg進(jìn)行灌胃，隨后每周兩次以50%CCl4橄欖油溶液1ml·kg-1進(jìn)行腹腔注射。模型組二第三周開始，每天放入人工氣候箱（溫度為32℃，濕度為90%）6小時(shí)，其他時(shí)間在室溫下飼養(yǎng)。所有組于第六周全部處死。

2.2 動(dòng)物取材

將大鼠禁食不禁水12小時(shí)，收集動(dòng)物各類生物樣本。

血清：10%水合氯醛將大鼠麻醉，劑量為0.3ml·100g-1。完全麻醉后，腹主動(dòng)脈取血。血液靜置3 h后，于4℃離心機(jī)4000 rpm離心10 min，取150 μl血清于1.5 ml離心管中，隨后放于冷凍盒中，-80℃冰箱中保存。血清取兩份，一份用于生化指標(biāo)檢測，一份供代謝組學(xué)檢測用。

肝臟：取血結(jié)束后，進(jìn)行肝臟分離，并稱量肝重，然后取肝臟最大葉中間部分組織固定于10%中性福爾馬林溶液中，進(jìn)行HE染色和Masson染色；其余部分放入凍存管，投入液氮中，之后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱，供代謝組學(xué)檢測用。

2.3 一般體征檢測

每周對(duì)大鼠體重、飲食量、飲水量等進(jìn)行兩次檢測，對(duì)毛色、糞便等進(jìn)行觀察。

2.4 生化指標(biāo)檢測

取150 μl大鼠血清，采用生化自動(dòng)分析儀對(duì)血清進(jìn)行TP、ALB、GLO、TBIL、ALP、GGT、TBA，采用南京建成生物工程研究所試劑盒按照說明書操作步驟對(duì)血清AST、ALT、SOD、MDA 及肝臟 Hyp進(jìn)行檢測。

2.5 代謝組學(xué)檢測

2.5.1 血清衍生化處理方法及GC/MS檢測條件[8]

取100 μl大鼠血清于1.5 ml離心管中，加入內(nèi)標(biāo)十七酸甲醇溶液（1mg·ml-1）10 μl（沿內(nèi)壁加入，不接觸血清）。加入300 μl甲醇、氯仿混合提取液（兩者體積比為3:1），渦旋振蕩30 s，放入-20℃冰箱中10 min進(jìn)行蛋白沉淀。隨后進(jìn)行10000 rpm離心10 min，吸取上清液300 μl于GC/MS進(jìn)樣瓶，30℃下用氮?dú)膺M(jìn)行吹干。加入甲氧胺吡啶溶液（15 mg·ml-1）80 μl，封蓋。渦旋振蕩30 s，在30℃的搖床中以250 rpm的頻率振蕩反應(yīng)90 min，進(jìn)行羰基反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，加入80 μl BSTFA（含1%TMCS），封蓋振蕩30 s，放入70℃烘箱中進(jìn)行反應(yīng)，60 min后取出后振蕩10 s。待GC/MS進(jìn)樣。

質(zhì)譜參數(shù)：離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃，AUX溫度260℃，高純氦氣流速1.0 ml·min-1，前進(jìn)樣口溫度270℃，離子源電壓為70 ev，溶劑延遲5 min。質(zhì)譜全掃描荷質(zhì)比掃描范圍（m/z）為30-600。升溫程序如下：80℃保持2 min，隨后以10℃·min-1速度升高到120℃保持4 min，以10℃·min-1速度升高到180℃，隨后以5℃·min-1速度升高到195℃保持3 min，以5℃·min-1速度升高到240℃保持3 min，以30℃·min-1速度升高到300℃保持7 min。最后以300℃再保持2 min。

2.5.2 肝臟衍生化處理方法及GC/MS檢測條件[9]

將冷凍的肝組織在冰浴中稱取50 mg于1.5 ml離心管中，加入3倍量的生理鹽水，用均漿機(jī)研磨成漿。加入提取劑甲醇500 μl，渦旋1 min，放入-20℃冰箱放置10 min。取上清 200 μl于GC/MS進(jìn)樣瓶中，30℃下氮?dú)獯蹈伞＜?0μl甲氧胺吡啶溶液（15mg·ml-1），封蓋。渦旋30 s。30℃搖床反應(yīng)90 min。加入80 μlBSTFA（含1%TMCS），封蓋振蕩30 s。70℃烘箱中反應(yīng)60 min，取出振10 s，待GC/MS進(jìn)樣。

質(zhì)譜參數(shù)：離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃，AUX溫度260℃，高純氦氣流速1.0 mL·min-1，前進(jìn)樣口溫度270℃，離子源電壓為70 ev，溶劑延遲5 min。質(zhì)譜全掃描荷質(zhì)比掃描范圍（m/z）為30-600。氣相色譜升溫程序如下：80℃保持2 min，隨后以10℃/min速度升高到120℃保持4 min，以10℃·min-1速度升高到180℃，隨后以5℃·min-1速度升高到195℃保持3 min，以5℃·min-1速度升高到240℃保持3min，最后以12.5℃·min-1速度升高到290℃保持15 min。最后升高到300℃保持2 min。

2.6 數(shù)據(jù)處理

生化指標(biāo)等統(tǒng)計(jì)采用mean±SD，T-test法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用GC/MS工作站及R軟件對(duì)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用多維統(tǒng)計(jì)及單維統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合的方法對(duì)差異代謝物進(jìn)行分析與鑒定，最終將同時(shí)滿足VIP＞1.0、單維統(tǒng)計(jì)p＜0.05的代謝物鑒定為最終差異代謝物，并通過 KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）數(shù)據(jù)庫聯(lián)合HMDB（http://www.hmdb.ca/metabolites/）檢索各種差異代謝物及其KEGG化合物號(hào)，通過KEGG Mapper（http://www.genome.jp/kegg/mapper.html）和 MBRole（Metabolites Biological Role，http://csbg.cnb.csic.es/mbrole/index.jsp）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路分析，選擇p＜0.05的代謝通路進(jìn)行深入分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 一般體征變化

大鼠造模開始，每周稱兩次體重，飲食量，飲水量，此處將按每周一個(gè)時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)體重變化趨勢(shì)，見表1及圖1。由圖表看出，造模開始，純四氯化碳灌胃急劇減輕大鼠體重，隨后模型組一和模型組二的大鼠體重增長明顯比正常組緩慢。模型組二比模型組一的大鼠體重增長更加緩慢。說明濕熱環(huán)境對(duì)大鼠體重增長具有抑制作用。根據(jù)不同組別的飲食量和飲水量的比較，發(fā)現(xiàn)飲水量在各組之間變化趨勢(shì)不明顯。而飲食量中，正常組每日飼料攝入量最多，其次是模型組一，最少組為模型組二，說明濕熱環(huán)境可以抑制大鼠飼料攝入量。隨著濕熱環(huán)境下造模時(shí)間增長，模型組二出現(xiàn)毛色發(fā)黃、大便稀溏、倦怠等癥狀。

3.2 生化指標(biāo)

取150 μl大鼠血清，采用自動(dòng)生化儀對(duì)TP、ALB、GLO、TBIL、ALP、GGT、TBA進(jìn)行檢測。血清中ALT、AST、MDA、SOD以及肝臟Hyp指標(biāo)則采用試劑盒進(jìn)行檢測。如表2。由結(jié)果可以看出ALT、AST、GLO、TBA、TBIL、Hyp共6個(gè)生化指標(biāo)在模型組與正常組中均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且模型組二比模型組一變化差異更大。TP、SOD、GGT三個(gè)生化指標(biāo)在模型組一與正常組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是在模型組二中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，通過生化指標(biāo)結(jié)果提示濕熱環(huán)境可以加重疾病的嚴(yán)重程度，圖2。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)三組大鼠體重表

圖1 不同組別大鼠體重隨時(shí)間變化趨勢(shì)圖

表2 各組血清生化指標(biāo)統(tǒng)計(jì)表

圖2 不同組別大鼠血清生化指標(biāo)柱狀圖

圖3 不同組別肝組織HE染色（×100）

3.3 組織病理觀察

肝組織HE染色結(jié)果顯示（圖3）：正常組肝臟結(jié)構(gòu)正常；中央靜脈旁肝細(xì)胞索呈放射狀排列，肝細(xì)胞體積較大。模型組一中大部分肝細(xì)胞腫大，發(fā)生脂肪性病變且病變區(qū)域多、面積大，病變區(qū)域占30%左右，炎癥細(xì)胞浸潤。模型組二中出點(diǎn)膠原纖維與網(wǎng)狀纖維沉積形成纖維間隔，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，脂肪性病變區(qū)域達(dá)35-40%。

肝組織Masson染色結(jié)果顯示（圖4）：正常組結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索排列整齊；模型組一中出現(xiàn)大量脂肪變性以及膠原纖維，分析該組全部動(dòng)物肝組織切片，大部分出現(xiàn)少量膠原纖維度。模型組二中出現(xiàn)大量脂肪變性以及數(shù)量較多的膠原纖維，一般膠原纖維不完全分隔包饒肝小葉，嚴(yán)重者出現(xiàn)膠原纖維沉積和形成明顯的假小葉。說明濕熱環(huán)境加重疾病模型嚴(yán)重程度。

3.4 血清代謝組學(xué)結(jié)果

圖4 不同組別肝組織Masson染色（×100）

圖5 模型組與正常組比較得分圖

通過PCA圖就可以看出正常組與模型組二分別出現(xiàn)不同區(qū)域的聚集，提示兩組之間存在一定差異，PLS-DA分析顯示這種差異更加清晰明顯（圖5）。為了獲得濕熱環(huán)境對(duì)模型影響的代謝物質(zhì)基礎(chǔ)，將模型組二與正常組比較，進(jìn)行OPLS分析，篩選符合VIP＞1.0并且p＜0.05條件的差異變量，最終定性分析獲得17個(gè)差異峰，結(jié)果見表3。

3.5 肝臟代謝組學(xué)結(jié)果

模型組二和正常組的肝臟代謝輪廓之間PCA分析結(jié)果可以看出在不同的區(qū)域聚集，說明兩組在肝臟部位代謝物差異明顯（圖6A）。PLS-DA得分圖顯示差異性更明顯（圖6B）。通過多維統(tǒng)計(jì)和單維統(tǒng)計(jì)，選擇VIP＞1并且單維統(tǒng)計(jì)p＜0.05的差異變量，對(duì)差異變量進(jìn)行鑒定核對(duì)，代謝差異物結(jié)果見表4。

3.7 血清、肝臟代謝通路分析

將血清、肝臟中篩選出的代謝差異物用MBRole數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析，計(jì)算出p小于0.05的差異性通路。如表5。可以看出血清、肝臟中存在4條共同的代謝通路，同時(shí)又具有各自特異的代謝通路。血清中有4條特異代謝通路，分別為Butanoate metabolism、Glycine,serine and threonine metabolism、Lysine degradation、Primary bile acid biosynthesis。肝臟中也有4條特異代謝通路，Arginine and proline metabolism、Biosynthesis of unsa-

表3 正常組與模型組二之間血清差異性代謝物列表

圖6 各模型得分圖及模型參數(shù)

表4 正常組與模型組二之間肝臟差異性代謝物列表

4 討論

4.1 濕熱環(huán)境與疾病體征、生化指標(biāo)

本研究發(fā)現(xiàn)正常環(huán)境下模型組比正常組大鼠體重明顯減輕，其原因?yàn)樗穆然荚斐桑窃跐駸岘h(huán)境下，與正常組相比體重減輕更加明顯，同時(shí)其飲食量也存在這種變化趨勢(shì)，即食欲不振。此外，濕熱組模型大鼠出現(xiàn)大便稀溏、體毛發(fā)黃，肛溫升高等體征，與臨床濕熱表現(xiàn)相似。劉曉鷹等[10]進(jìn)行IgA腎病濕熱證模型復(fù)制時(shí)，模型組大鼠出現(xiàn)了聳毛、食欲不振、大便稀溏等現(xiàn)象。復(fù)制脾胃濕熱證大鼠模型過程中發(fā)現(xiàn)溫病濕熱證動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)肛溫升高、體重減輕、飲食減少、活動(dòng)減少、大便黏滯等癥狀，在慢性胃炎大鼠濕熱證中，也發(fā)現(xiàn)正常組體重高于單純胃炎組體重，單純胃炎組高于脾胃濕熱組[11]。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。說明了濕熱環(huán)境因素抑制了大鼠體重的增長，并導(dǎo)致類似臨床濕熱癥狀的出現(xiàn)。

血清中ALT、AST含量高低是肝細(xì)胞損害程度指標(biāo)之一。兩項(xiàng)指標(biāo)在濕熱環(huán)境下模型組中比正常環(huán)境下模型組變化更明顯，提示濕熱環(huán)境加重肝細(xì)胞損傷。臨床研究發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎肝膽濕熱證與ALT、AST、GLO、TBIL、GGT等生化指標(biāo)存在直線正向相關(guān)關(guān)系[12-14]。研究中正常環(huán)境下模型ALT、AST、GLO、TBA、TBIL、ALP與正常組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而濕熱環(huán)境下這些生化指標(biāo)的差異性進(jìn)一步增大，同時(shí)，TP、SOD、GGT三個(gè)指標(biāo)也出現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明濕熱環(huán)境會(huì)使疾病的嚴(yán)重程度加重，與臨床研究相似。從組織病理切片（HE染色，Masson染色）結(jié)果中可以進(jìn)一步濕熱環(huán)境會(huì)加速疾病的進(jìn)展以及加重疾病嚴(yán)重程度。

4.2 濕熱環(huán)境影響疾病進(jìn)展的物質(zhì)基礎(chǔ)

通過生化指標(biāo)、病理組織結(jié)果可以得出模型組二比模型組一疾病狀態(tài)更嚴(yán)重，說明濕熱環(huán)境加重疾病嚴(yán)重程度。為尋找疾病嚴(yán)重程度與體內(nèi)代謝物質(zhì)水平之間的關(guān)聯(lián)，通過代謝組學(xué)PCA和PLS-DA模型分析分別在血清、肝臟中找到17、34種差異代謝物，大部分代謝物在濕熱環(huán)境中比正常環(huán)境水平變化更明顯，如血清中Mannose、Cholesterol、Oxaloacetate、Glutarate；肝臟中變化明顯脂肪酸如Stearic acid，Hexadecanoic acid。對(duì)差異代謝物進(jìn)行通路分析，發(fā)現(xiàn)ABC transporters、Alanineaspartateglutamate metabolism、Aminoacyl-tRNA biosynthesis、Galactose metabolism在血清、肝臟中均發(fā)生了變化。在血清、肝臟中還發(fā)現(xiàn)各自特有代謝通路，其中血清中有4條，肝臟包含4條。將代謝通路進(jìn)行歸類分析，血清中代謝通路主要為氨基酸代謝，肝臟中主要為脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝為主，如圖7。血清、肝臟中均發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝存在異常，血脂異常則會(huì)促使一些炎癥因子分泌，如IL-6、TNF-α等表達(dá)增加，進(jìn)而啟動(dòng)了一系列物質(zhì)表達(dá)和信號(hào)傳遞異常[15]。藥物肝毒性會(huì)引起肝細(xì)胞內(nèi)長鏈脂肪酸代謝發(fā)生紊亂，尤其是脂肪酸的氧化過程，脂類化合物水平會(huì)發(fā)生顯著變化[16]，這些改變意味著肝損傷大鼠體內(nèi)氨基酸代謝、脂代謝、膽汁酸代謝以及體內(nèi)氧化-抗氧化作用失衡[17]。濕熱環(huán)境則進(jìn)一步加重了這些代謝水平紊亂導(dǎo)致加深疾病嚴(yán)重程度。

表5 血清、肝臟差異性通路列表

圖7 血清、肝臟代謝通路分析

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