速效救心丸治療心肌缺血疾病的網絡藥理學研究＊

雷 偉，鄧艷芳，姜 民，白 剛

（南開大學藥學院 天津 300350）

缺血性心臟病是最嚴重的心血管疾病之一，在全世界都有較高的發(fā)病率和死亡率[1]。心肌缺血是指心肌耗氧量和冠狀動脈供血、供氧之間不平衡而導致的缺血性心臟病[2]。目前治療心肌缺血的藥物主要包括以下幾大類：亞硝酸酯和硝酸酯類、Ca2+拮抗劑類、血管緊張素轉換酶（ACE）抑制劑、β-受體阻滯劑和心肌代謝藥[3]。由于以上成分單一的化藥會出現嚴重的耐藥性，不良反應如頭痛、頭暈、面紅、低血壓等和嚴格的使用禁忌，使得人們將發(fā)現抗心肌缺血疾病治療藥物的目光投向了多成分、多靶點和多條生物代謝途徑協同發(fā)揮作用的中藥。

速效救心丸是由川芎、冰片組成的中藥復方，臨床上它被廣泛應用于心腦血管疾病。近30年的臨床應用中，速效救心丸被廣泛用來治療冠心病、心絞痛、心肌梗死等疾病，并獲得了很好的療效，且無明顯副作用和藥物抵抗[4-6]。速效救心丸中研究較為廣泛的化學成分有藁本內酯、洋川芎內酯I、川芎嗪、阿魏酸等。藁本內酯是川芎揮發(fā)油中的主要成分，也是速效救心丸的主要成分；前人對其研究顯示藁本內酯能夠抑制由氯化鈣和去甲腎上腺素酒石酸導致的離體腹主動脈收縮，暗示藁本內酯的作用類似于鈣離子拮抗劑維拉帕米[7]，藥代學研究顯示藁本內酯在體內主要經歷氧化、還原、水解的I相代謝和與氨基酸、葡糖苷酸、谷胱甘肽等結合的Ⅱ相代謝反應[8]。川芎嗪作為重要的生物堿類成分能夠激活PI3K/AKT通路[9]，減少缺血導致的心肌細胞電功能紊亂。阿魏酸作為重要的酚酸類成分，能夠增強內皮生長因子和血小板源生長因子的表達，上調低氧誘導因子mRNA和蛋白的表達等[10]?，F代藥理學研究發(fā)現速效救心丸能夠有效改善心肌缺血，增加冠脈血流，減少心肌梗死面積等。但由于其化學成分復雜、結構多樣，以及缺乏合適的分析方法，使得速效救心丸分子網絡層面的研究仍未見報道。

網絡藥理學是從整體層面上來研究藥物與機體之間的相互作用關系，通過網絡分析方法系統整合并可視化多成分與多靶點之間的相互作用；網絡藥理學遵循勒夏列特原理，即認為生物體的健康狀態(tài)是一個平衡體系，疾病會使這個平衡體系發(fā)生偏移，而藥物能使這個平衡體系的改變減弱(1)任郭珉.基于文本挖掘的藥用植物數據庫的建立及網絡藥理學分析D.北京:北京協和醫(yī)學院碩士學位論文,2014.；這種思想與中醫(yī)藥“整體觀”的傳統理論相吻合，因此網絡藥理學在系統生物整體角度闡明中藥發(fā)揮作用的潛在機制方面得到了廣泛的應用，已經初步完成了對茵陳蒿湯、四物湯、清肺消炎丸等的機制預測[11-13]。

本研究通過網絡藥理學研究技術挖掘速效救心丸主要活性成分的作用靶點，構建成分-靶點網絡，并通過蛋白互作分析預測靶點之間的相互作用關系，從分子網絡層面系統地闡明速效救心丸對心肌缺血疾病的多成分、多靶點、多生物途徑的作用機制。

1 材料與方法

1.1 化合物信息

化合物信息：1.龍腦（C10H8O），2.咖啡酸（C9H8O4），3.藁本內酯（C12H14O2），4.丁基苯酞（C12H14O2），5.川芎嗪（C8H12N2），6.川芎內酯G（C12H16O3），7.川芎內酯F（C12H14O3），8.川芎內酯 D（C12H14O4），9.川芎內酯 C（C12H12O3），10.川芎內酯A（C12H16O2），11.川芎內酯I（C12H16O4），12.川芎內酯E（C12H12O3），13.阿魏酸（C10H10O4），14.4,7-二羥基-4丁基苯酞（C12H14O4），15.3-丁基-4-羥基苯酞（C12H14O3），16.丁烯苯酞（C12H12O2），17.原兒茶酸（C7H6O4），18.香草酸（C8H8O4），19.蛇床內酯（C12H18O2），20.阿魏?？鼘幩幔–17H20O9），21.二聚藁本內酯（C24H28O4），22.二聚藁本內酯（C24H30O4）。以上化合物的化學信息引自美國化學文摘數據庫（Chemical Abstract Service，CAS），并將每個化合物的結構使用ChemBioOffice 2010軟件轉化成PharmMapper可識別的.sdf格式。

1.2 化合物吸收能力預測

對速效救心丸中鑒定的化合物進行吸收性質的計算預測，采用五原則、TPSA和旋轉鍵數的方法進行。

（1）五原則：1997年Lipinski對2287藥物分子的結構特征進行了分析，這2287個分子基本上通過了一期臨床的實驗。分析結構表明，如果一個藥物分子具有好的吸收和穿透特性，應符合下面的規(guī)則：①氫鍵給體（連接在N和O上的氫原子數）數目小于5；②氫鍵受體（N和O的數目）數目小于10；③相對分子質量小于500；④脂水分配系數小于5。

化合物同時不符合四個限制條件的任意兩個，其吸收不好預測準確率可達90%以上，若同時不符合三個條件，預測結果就會相當可靠。

藥物分子量由ChemBioOffice 2010軟件（Cambridge-Soft Corporation）計算，ClogP由CloP 4.0 program軟件（BioByte Corporation，Claremont，CA）計算，氫鍵給體、氫鍵供體、TPSA和旋轉鍵數由互聯網Molinspiration Property Calculation Services計算

1.3 潛在作用靶點反向預測

以藥物小分子為探針，搜索活性小分子的潛在蛋白靶點，據此預測藥物小分子的活性，此為“反向藥效團匹配方法”[14]。將化合物.sdf文件上傳至PharmMapper數據庫（http://59.78.96.61/pharmmapper/），選擇允許化合物存在構象變化，最大構象數設在100，選擇靶點集限定于人，產生虛擬篩選結果。在Uniprot數據庫中，將PharmMapper得到的蛋白名稱使用UniprotKB搜索功能轉化為蛋白標準名稱。

1.4 代謝通路預測

通常認為，藥物靶點富集的通路，即是藥物能夠干擾和調控的代謝通路，我們使用MAS 3.0（http://bioinfo.capitalbio.com/mas3/）生物分子功能注釋平臺對靶點蛋白進行GO富集分析和KEGG通路注釋分析。對于篩選出的代謝通路，人為選擇p值小于0.01，即相關性較大的代謝通路，進行后續(xù)分析。

1.5 活性成分-靶點-通路網絡構建

采用Cytoscape軟件的Merge功能對速效救心丸的活性成分、靶點蛋白、富集通路進行網絡模型構建[15]?；钚猿煞帧悬c蛋白、代謝通路以不同顏色和形狀的節(jié)點表示，活性成分與其作用靶點蛋白之間用邊連接起來，靶點蛋白與其富集的通路之間也用邊連接，當某一活性成分、代謝通路作用于相同的靶點蛋白時，活性成分和代謝通路也可連接起來。

1.6 蛋白互作分析

將速效救心丸中吸收較好的化合物靶點蛋白輸入String 9.1（http://String-db.org/）數據庫中，進行蛋白相互作用信息的收集。選取蛋白相互作用得分值大于0.7的蛋白互作關系，將獲得數據導入Cytoscape軟件，進行功能模塊分析。

蛋白質通過彼此之間相互作用結合成一個集合體來完成生物學功能，這些緊密聯系的結合體即為功能模塊[16]。MCODE算法是一種基于圖論的聚類算法，它能夠在大規(guī)模蛋白質網絡中檢測出稠密連通區(qū)域即功能模塊，并對模塊中蛋白的關聯程度進行打分[17]。本實驗采用MCODE算法對速效救心丸的蛋白互作網絡進行模塊識別，將識別模塊大小的K-core設為3，即識別出的功能模塊至少含有4條邊。利用Cytoscape中的BinGO插件對識別出的不同功能模塊進行功能注釋，其中顯著性選擇0.05。通過分析蛋白互作關系，有利于從系統層面研究速效救心丸的藥效機制。

2 結果

2.1 化合物吸收能力分析

血清藥物化學的觀點認為，藥物中被吸收入血的成分才有可能被血液輸送到作用器官或部位來發(fā)揮藥效，因此化合物能否被人體有效吸收是決定其是否發(fā)揮藥效的重要標準。速效救心丸中，能夠被有效檢測到的化合物有22種，將這些化合物通過五原則、TPSA和旋轉鍵數篩選方法進行篩選，共預測到19個吸收較好的化合物，結果如表1。

2.2 速效救心丸成分-靶點-代謝通路網絡

將19個吸收較好的化合物結構信息投入到PharmMapper數據庫中進行反向靶點預測，將PharmMapper返回的靶點蛋白與Pubmed數據庫文獻檢索的結果進行整合。19個化合物對應的靶點蛋白依據匹配度（fit value）進行篩選，共得到71個相關性較大的靶點蛋白，將對應的靶點蛋白標準名稱投入Mas 3.0中，進行代謝通路預測，篩選出與心肌缺血相關的代謝通路53條，建立活性成分-靶點-代謝通路網絡如圖1、表2。從網絡藥理學研究結果顯示，速效救心丸中19個主要成分涉及的代謝通路有MAPK信號通路、氨基酸代謝、VEGF信號通路、PPAR代謝通路等。

2.3 蛋白互作分析

心肌缺血疾病是復雜疾病，其發(fā)生發(fā)展必定涉及到許多具有生物功能的蛋白與蛋白之間的相互作用，因此研究速效救心丸的靶點蛋白與蛋白之間互作分析有助于揭示速效救心丸改善心肌缺血疾病的潛在機制。借助String 9.1（http://String-db.org/）數據庫，對速效救心丸的靶點蛋白進行互作分析結果如圖2。蛋白質通過彼此之間相互作用結合成一個集合體來完成生物學功能，這些緊密聯系的結合體即為功能模塊。識別功能模塊借助的是MCODE算法，它是一種基于圖論的聚類算法，它能夠在大規(guī)模蛋白質網絡中檢測出稠密連通的功能模塊，并對模塊中蛋白的關聯程度進行打分。借助MCODE算法和BinGo分析對速效救心丸蛋白互作網絡中的功能模塊進行識別和解讀，有利于從系統層面研究速效救心丸的藥效機制（圖3，表3）。從蛋白互作網絡中識別出5個主要的功能模塊，分別與脂質和固醇荷爾蒙的相關代謝、谷胱甘肽和氨基酸的相關代謝、炎癥反應和免疫功能、心肌功能和能量供應及血壓調節(jié)等方面相關。蛋白互作分析結果顯示速效救心丸中主要化學成分通過調節(jié)心臟能量供應、脂質紊亂、免疫反應等發(fā)揮了改善心肌缺血疾病的作用。

表1 化合物吸收能力預測

圖1 “成分-靶點-通路”藥理學網絡” 化學成分，靶點蛋白，代謝通路

圖2 19個成分對應靶點蛋白的蛋白互作分析網絡

表2 網絡藥理學“成分-靶點-通路”表格

圖3 蛋白互作網絡中識別的主要功能模塊

3 討論

脂質是人體內大量存在的代謝物，它參與了人體中許多重要的生物學過程：血小板激活、細胞信號傳導、細胞骨架形成等[18,19]。伴有冠脈硬化的冠心病中，脂質代謝的紊亂也與炎癥、氧化應激、巨噬細胞凋亡密切相關[20]；隨年齡增大發(fā)生的線粒體功能紊亂和異常的線粒體脂肪酸氧化密不可分，與此同時異常的線粒體脂肪酸氧化也增加了冠心病的發(fā)生風險[21]。除了脂質代謝與冠心病相關外，固醇荷爾蒙代謝也與冠心病關系密切。硫酸化的腎上腺激素DHEAS對胰島素敏感性和脂質代謝發(fā)揮了直接作用關系，并且降低的DHEA和DHEAS血清濃度預示了增加的冠心病風險[22]；基于UPLC-QTOF/MS的代謝組學試驗中，Cer(t18:0/16:0)、Cer(d18:0/12:0)、Cer(d18:0/14:0)等固醇荷爾蒙可以作為潛在的生物標志物來區(qū)分健康者與穩(wěn)定心絞痛患者、急性冠心病患者[23]。因此，脂質代謝和固醇荷爾蒙相關代謝是冠心病發(fā)生、發(fā)展過程中的重要代謝通路，積極控制脂質代謝和固醇荷爾蒙代謝的紊亂能夠有效改善冠心病。前人研究顯示，速效救心丸能夠降低ApoE敲除小鼠的血清甘油三酯的水平，并能夠穩(wěn)定動脈粥樣硬化的斑塊[24]。我們的網絡藥理學研究顯示，MCODE算法識別的功能模塊1包括了脂質代謝(GO:0071396、GO:0033993)和固醇荷爾蒙代謝(GO:0043401、GO:0071383、GO:0048545)，因此我們推測速效救心丸可以通過調節(jié)脂質代謝和固醇荷爾蒙類代謝發(fā)揮其改善冠心病的作用。

表3 代謝通路Go功能富集分析

氨基酸代謝在冠心病發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，它的變化與機體的氧化應激、能量供應等密切相關。氨基酸是重要的能量先導體，它能夠增加體內ATP的形成并在心肌缺血疾病中，對心肌細胞發(fā)揮能量供給作用[25,26]。組氨酸既是自由基清除劑，作為組胺的前體又是機體的能量供應；纈氨酸、色氨酸、異亮氨酸等都可以作為心臟的能量替代供應者[26]。心肌缺血會破壞心肌細胞的結構，增加心肌細胞蛋白水解[27]，因此調節(jié)氨基酸相關代謝有助于心肌細胞的結構重建并有助于補充和修復胞內蛋白。在冠心病患者心肌缺血的狀態(tài)下，藥物對氨基酸代謝的改善，能夠增加對心肌的能量供應，維持心肌細胞的正常結構和功能。本研究的功能模塊2將速效救心丸的功能富集在氨基酸相關代謝通路（GO:0006575、GO:0043603、GO:1901564），功能模塊4包括AMP相關代謝（GO:0046033）、糖類代謝（GO:1901136）等都與能量供應相關。這說明速效救心丸可以通過改善冠心病患者的氨基酸和糖代謝等來改善心肌的能量供應，維持心肌細胞的結構和功能。功能模塊2還包括谷胱甘肽相關代謝（GO:0006749），谷胱甘肽是體內重要的抗氧化劑[28]，速效救心丸對谷胱甘肽代謝過程的調節(jié)能夠改善機體的氧化應激，減少自由基對機體的損傷，與此同時它還能夠通過干擾嘌呤代謝（GO:0006163、GO:0006198）來直接減少自由基的產生。有研究報道川芎嗪能夠直接清除超氧陰離子，并抑制誘導性NO的產生[29]，這一研究驗證了我們基于網絡藥理學的推測。

在冠心病的發(fā)生、發(fā)展過程中伴隨著免疫炎癥反應，有研究顯示在早發(fā)性冠心病患者體內，IL-18、IL-6、IL-10、TNF-α的基因啟動子單核苷酸多態(tài)性與健康人的存在明顯變化，這些基因啟動子單核苷酸多態(tài)性的差異以及對應血清內細胞因子的濃度變化可以幫助我們解釋早發(fā)性冠心病患者體內免疫炎癥反應的誘發(fā)[30]。冠心病并發(fā)癥如牙周疾病等患者體內，血清炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、TNF-γ的水平發(fā)生了明顯改變[31]。速效救心丸網絡藥理學研究中功能富集分析得到的功能模塊3主要包括了與免疫調節(jié)和炎癥反應相關的代謝通路如GO:0043406、GO:0002757、GO:0002253、GO:0050778等，此外有文獻報道藁本內酯能夠抑制ERK、JNK和p38[32]，抑制MAPK通路，川芎嗪能夠增強Nf-κB抑制劑和抗炎因子IL-10的表達[33]。綜上，速效救心丸能夠通過發(fā)揮免疫調節(jié)和改善炎癥反應來發(fā)揮治療冠心病的作用。

腎素-血管緊張素系統的調節(jié)與內皮功能密切相關，它能夠改善高血壓患者體內的內皮功能紊亂[34]，腎素-血管緊張素系統的抑制劑如血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素受體阻斷劑在治療心絞痛方面發(fā)揮了有效的作用[35]。功能模塊5顯示速效救心丸的藥效發(fā)揮與腎素-血管緊張素系統的調節(jié)相關如GO:0001991、GO:0002016、GO:0003081等，速效救心丸通過對腎素-血管緊張素系統的干預來實現對血壓等的調節(jié)。

綜上所述，本研究對速效救心丸中的主要成分進行了吸收能力篩選，共篩得19個原型吸收較好的化合物，對19個化合物及相關蛋白靶點和對應代謝通路進行了整合，并對靶點進行了蛋白互作分析，進而對蛋白互作網絡進行了功能富集分析。研究結果顯示速效救心丸主要是通過調節(jié)脂質代謝和固醇荷爾蒙代謝、氨基酸代謝、免疫調節(jié)和炎癥反應、腎素-血管緊張素系統調節(jié)來改善冠心病患者的氧化應激、能量供應、免疫功能、炎癥反應、血壓變化。本實驗借助網絡藥理學研究方法從分子網絡層面解釋了速效救心丸治療冠心病的潛在藥效機制，為速效救心丸的深入藥效研究奠定了基礎。

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