藥用植物三尖杉及其同屬易混物種的DNA條形碼鑒定研究＊

黃宇航，曾卓爾，成 航，鄧 港，駱帥賓，麥倩婷，高 翰，劉 霞＊＊

（1.武漢理工大學化學化工與生命科學學院 武漢 430070;2.武漢市外國語學校高中部 武漢 430022）

三尖杉Cephalotaxus fortunei Hook.f.是一種藥用植物，我國民間將其帶嫩枝的葉作為消積、潤肺和驅蟲藥[1]。三尖杉廣泛分布于秦嶺以南的部分省區(qū)，垂直分布從東（約200 m）到西（2 500 m）逐漸升高。一般常與闊葉樹、針葉樹混雜，呈零星分布[2,3]。三尖杉中含有生物堿和黃酮兩大類化學成分[4]，其中三尖杉酯類生物堿具有抗癌活性[5]。20世紀70年代初，Powell等發(fā)現(xiàn)三尖杉中的三尖杉酯堿類化合物具有抑制小鼠白血病細胞生長的作用，從而引起人們對其生物堿類成分的廣泛研究和重視[6-9]。目前，我國已將三尖杉酯堿（harringtonine,HT）和高三尖杉酯堿（homoharringtonine,HHT）開發(fā)成抗癌藥物，對急性非淋巴細胞性白血病和慢性粒細胞性白血病有較好療效[10,11]。由于其抗癌功效良好，三尖杉已被過度商業(yè)采伐，目前處于漸危狀態(tài)并且種群數(shù)量正在下降[12,13]。

由于三尖杉的藥用部位主要為葉，與其他同屬近緣物種形態(tài)極其相似[14]，使得利用形態(tài)特征對三尖杉進行快速、有效鑒別稍顯困難[15]。同時，郎學東等[16,17]提出對于三尖杉屬植物的系統(tǒng)分類尚存爭議，這使得利用已有文獻對三尖杉進行形態(tài)學鑒定變得更為復雜。經(jīng)過走訪市場發(fā)現(xiàn)，其最常見的同屬易混物種為粗榧Cephalotaxus sinensis(Rehd.et Wils.)Li和蓖子三尖杉Cephalotaxus oliveri Mast.。市場上流通的混淆物種會威脅三尖杉的用藥安全。目前，針對三尖杉屬植物的鑒別方法除有形態(tài)學鑒別外，還有顯微鑒別[18]和薄層色譜分析[19]等。上述方法均存在不同程度的局限性。所以需要探索一種針對三尖杉及其易混物種高效、快捷的新型鑒定方法。

DNA條形碼技術是一種利用基因中相對較短的特異性序列來進行物種分類學鑒定的分子生物學技術[20]。該技術與傳統(tǒng)鑒定技術相比，在物種鑒別時具有高穩(wěn)定性、高準確性的特點[21]，對于保障中藥材用藥安全準確具有重要意義[27]。目前，該技術已經(jīng)在植物系統(tǒng)學分類等領域得到廣泛應用，并已成功應用于蔓荊子、車前子、羌活等多種中藥材的鑒別中[22-26]，但目前尚未發(fā)現(xiàn)運用DNA條形碼技術鑒定三尖杉的相關報道。本研究基于DNA條形碼技術，探索ITS2和psbA-trnH序列作為三尖杉及其屬內易混物種條形碼序列的可行性，以規(guī)范三尖杉藥材的選用，保障其用藥安全。

表1 采集樣品信息表

1 材料和方法

1.1 材料

本實驗通過野外考察等方式收集三尖杉屬3個物種（三尖杉、粗榧和蓖子三尖杉）共22份植物樣本，其中三尖杉6份、粗榧8份、蓖子三尖杉8份，分別來自湖北、云南等地。所有樣品均經(jīng)武漢理工大學樓一層教授鑒定，憑證標本保存在武漢理工大學中藥資源與分子鑒定實驗室。詳細樣品信息見表1。本研究另從GenBank數(shù)據(jù)庫下載上述3物種psbA-trnH序列共10條，Genbank登錄號見表2。

表2 psbA-trnH下載序列信息表

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

參照中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則[28,29]，取經(jīng)硅膠干燥的樣品葉片約20 mg，經(jīng)75%乙醇擦拭后，用高通量組織研磨儀（Sceintz-48，寧波新芝）以30次/min研磨2 min。利用核分離液（2%PVP，20 mmol?L-1EDTA，100 mmol?L-1PH 8.0 Tris-HCl和0.7 mol?L-1NaCl）800 μL抽提2次后，利用基因組DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.,China）提取DNA。

1.2.2 PCR擴增及測序

ITS2和psbA-trnH序列PCR擴增引物及反應條件參見《中藥DNA條形碼分子鑒定》[29]，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測并對有清晰目的條帶的樣品進行純化后，使用ABI 3730XL測序儀（Applied Biosystems Co.,USA）進行雙向測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

利 用 CodonCode AlignerV4.2（CodonCode Co.,USA）對測序峰圖文件進行序列拼接和剪切，去除低質量部分。將所得序列采用基于隱馬爾科夫模型HMMer注釋的方法，在ITS2 database網(wǎng)站進行注釋，剪去所得序列的5.8S端和28S端，獲得ITS2序列[30-32]。通過與Genbank序列進行Blast比對，并利用參考序列進行注釋，獲得psbA-trnH序列。使用MEGA 5.1（Molecular Evolutionary Genetics Analysis Co.,USA）軟件進行序列比對分析[33]。分別基于兩種序列，利用K2P（Kimura 2-Parameter）模型計算各物種遺傳距離并分析，構建Neighbor-Joining（NJ）系統(tǒng)聚類樹，并采用bootstrap重復1 000次對各分支的支持率進行檢驗[33]。

2 結果

2.1 三尖杉及其同屬易混物種的種內變異分析

2.1.1 基于ITS2序列的種內變異分析

三尖杉、粗榧和蓖子三尖杉的ITS2序列特征見表3。三尖杉共6條序列，長度均為233 bp，以SJ-001為主導單倍型。在132 bp處存在A-C變異；152 bp處存在C-T變異；161 bp處存在T-C變異；175 bp處存在CG變異。平均GC含量為69.30%。粗榧共8條序列，長度為223-237 bp，存在分別以CF-001、CF-003為主導單倍型的2種單倍型。在108 bp處存在G-A變異；在117 bp處存在A-G變異。平均GC含量為66.75%。蓖子三尖杉共8條序列，長度為223-233 bp，存在分別以BZ-001、BZ-007為主導單倍型的2種單倍型。在235 bp處存在A-C變異。平均GC含量為69.50%。

表3 三尖杉及其同屬易混物種ITS2序列特征表

表4 三尖杉及其同屬易混物種psbA-trnH序列特征表

2.1.2 基于psbA-trnH序列的種內變異分析

三尖杉、粗榧和蓖子三尖杉的psbA-trnH序列特征見表4。三尖杉共10條序列，長度為313-390 bp，以SJ-001為主導單倍型。不存在種內變異位點。平均GC含量為39.90%。粗榧共12條序列，長度為390-490 bp，存在分別以CF-003、CF-005為主導單倍型的2種單倍型。存在99個種內變異位點。平均GC含量為41.10%。蓖子三尖杉除BZ-007擴增失敗，共獲得9條序列，長度為268-364 bp，以BZ-001為主導單倍型。不存在種內變異位點。平均GC含量為40.00%。

2.2 三尖杉及其同屬易混物種的種內及種間遺傳距離計算

2.2.1 基于ITS2序列的遺傳距離計算

基于ITS2序列，利用K2P模型計算所得的遺傳距離見表5。三尖杉的最大種內遺傳距離（0.0087）小于與粗榧的最小種間遺傳距離（0.7424）、小于與篦子三尖杉的最小種間遺傳距離（0.7424），表明可利用ITS2序列將三尖杉與這兩個易混物種區(qū)分。

2.2.2 基于psbA-trnH序列的遺傳距離計算

基于psbA-trnH序列，利用K2P模型計算所得的遺傳距離見表6。由于三尖杉和粗榧的最小種間距離為0，與三尖杉種內遺傳距離相等，表明利用psbA-trnH序列無法區(qū)分三尖杉和粗榧兩物種。

2.3 NJ系統(tǒng)聚類樹構建

2.3.1 基于ITS2序列的NJ樹

應用相似性搜索法，構建了基于ITS2序列的NJ系統(tǒng)聚類樹，見圖1。圖中三尖杉、粗榧和蓖子三尖杉各自聚為一支，表現(xiàn)出良好的單系性。表明利用ITS2序列作為DNA條形碼，可以對三尖杉與其易混物種進行有效鑒定。

2.3.2 基于psbA-trnH序列的NJ樹

基于psbA-trnH序列所構建的NJ系統(tǒng)聚類樹見圖2。圖中三尖杉雖與蓖子三尖杉分開，但與粗榧聚為一支。表明利用psbA-trnH序列作為DNA條形碼，無法對三尖杉與其兩個易混物種進行鑒定。

表5 基于ITS2序列的三尖杉及其同屬易混物種遺傳距離信息表

表6 基于psbA-trnH序列的三尖杉及其同屬易混物種遺傳距離信息表

3 討論

DNA條形碼技術作為在生物分類和鑒定領域一項發(fā)展迅速的新技術，在保障藥用植物用藥安全和保護瀕危物種等方面具有潛力。本研究基于三尖杉及其2個易混物種共53條序列（ITS2序列22條、psbA-trnH序列31條）進行比對分析，探索利用DNA條形碼技術用于鑒定藥用植物三尖杉的可行性。

通過ITS2序列分析發(fā)現(xiàn)，三尖杉、粗榧和蓖子三尖杉的序列種內變異均較小，作為DNA條形碼具有良好的穩(wěn)定性。三尖杉ITS2序列種內最大K2P遺傳距離小于與易混物種的種間最小K2P遺傳距離；基于ITS2序列構建的NJ樹表明三尖杉能與其易混物種明顯區(qū)分。而三尖杉的psbA-trnH序列種內最大K2P遺傳距離等于其與易混物種的種間最小K2P遺傳距離；基于psbA-trnH序列構建的NJ樹顯示三尖杉無法單獨聚為一支。因此，ITS2序列可以作為有效鑒定三尖杉及其易混物種的合適DNA條形碼序列，而psbA-trnH序列不適合用于三尖杉及其易混物種的鑒定。確定ITS2序列作為鑒定三尖杉的DNA條形碼，對于保障其用藥安全和準確性都有一定的意義[34]，同時也為其他近緣藥用植物的鑒定提供了思路和經(jīng)驗。

圖1 基于ITS2序列的NJ系統(tǒng)聚類樹

圖2 基于psbA-trnH序列所構建的NJ系統(tǒng)聚類樹

1 白雪芳,杜昱光.抗腫瘤藥物-三尖杉酯類堿的開發(fā)研究進展.中國生化藥物雜志,1998,19(1):50-52.

2 中國科學院植物研究所.中國植物志（第四卷）.北京:科學出版社,1999:85-88.

3 中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒（第一卷）.北京:科學出版社,1985:330.

4 馬廣恩,林隆澤,趙志遠,等.三尖杉屬植物中生物堿的研究:I.三尖杉中抗癌有效成分的分離和鑒定及新生物堿(+)－乙酰三尖杉堿.化學學報,1977,35(3,4):201-208.

5 浙江省三尖杉研究協(xié)作組.三尖杉植物生物堿的臨床研究.浙江腫瘤通訊,1976,(2):14.

6 Powell R G.Structures of Harringtonia,Alkaloids from Cephalotaxuarringtonia.Phytochemistry,1972,11(4):1467-1472.

7 Powell R G,Weisleder D,Smith C R Jr.Antitumor Alkaloids from Cephalotaxus harringtonia:Structure and Activity.J Pharm Sci,1972,61(8):1227-1230.

8 Ma G,Sun G Q,Elsohly M A,et al.Studies on the Alkaloids of Cephalotaxus.III.4-Hudroxycephalotaxine,a New Alkaloid from Cephalotaxus fortunei.J Nat Prod,2004,45(5):585-589.

9 Bocar M,Jossang A,Bodo B.New alkaloids from Cephalotaxus fortunei.J Nat Prod,2003,66(1):152-154.

10 Smith C R,Mikojajczals K L,Powell K G.Anticancer Agents Based on Natural product Models.NewYork:Academic Press,1980.

11 梅文莉,吳嬌,戴好富.三尖杉屬植物化學成分與藥理活性研究進展.中草藥,1992,15(5):14-16.

12 王有生,王獻博.三尖杉屬植物資源利用與保護.中藥材,1992,15(5):14-16.

13 Huang C T,Zhuang X Y,Li R X,et al.Damaged Status and Early Recovery of Tree Species in Wuzhishan of Nanling Mountains,South China after the Ice Storm in 2008.Chin J Ecology,2012,31(6):1390-1396.

14 熊文愈,等.中國木本藥用植物.上海:上?？萍冀逃霭嫔?1983:46-52.

15 馬英姿,李志華.生藥三尖杉及其易混物種的性狀與顯微鑒別.湖南中醫(yī)藥導報,2000,6(1):40-41.

16 郎學東,蘇建榮,陸樹剛,等.三尖杉屬屬名和三尖杉名稱的引證錯誤與訂正.西北植物學報,2011,31(12):2572-2575.

17 郎學東.三尖杉屬系統(tǒng)分類學研究.昆明:云南大學博士學位論文,2013.

18 齊迎春,易華林,梁學藝.三尖杉的形態(tài)組織鑒定.中藥材,2001,24(6):407-409.

19 董慧茹,鄭云,趙京城,等.薄層色譜法分離紫杉醇和三尖杉寧堿.理化檢驗-化學分冊,2007,43(6):472-475.

20 陳士林,龐曉慧,姚輝,等.中藥DNA條形碼鑒定體系及研究方向.世界科學技術—中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2011,13(5):747-754.

21 陳士林,姚輝,韓建萍,等.中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則.中國中藥雜志,2013,38(2):141-147.

22 張曉存,徐迪,孫偉,等.蔓荊子藥材及其混偽品DNA條形碼鑒定研究.世界科學技術—中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2014,16(11):2366-2370.

23 樊佳佳,宋明,宋馳,等.中藥材蟾皮及其混偽品的DNA條形碼鑒定研究.中國藥學雜志,2015,50(15):1292-1296.

24 王俊,劉霞,孫偉,等.名貴中藥材血竭的DNA條形碼研究.中國藥學雜志,2015,50(15):1261-1265.

25 宋明,張雅琴,林韻涵,等.基于ITS2和psbA-trnH序列對細小種子類藥材車前子的鑒定比較.中國中藥雜志,2014,39(12):2227-2232.

26 張改霞,金鉞,賈靜,等.藥用植物羌活種子DNA條形碼鑒定研究.中國中藥雜志,2016,41(3):390-395.

27 辛天怡,李西文,姚輝,等.中藥材二維DNA條形碼流通監(jiān)管體系研究.中國科學:生命科學,2015,45(7):695-702.

28 陳士林.中國藥典中藥材DNA條形碼標準序列.北京:科學出版社,2015.

29 陳士林.中藥DNA條形碼分子鑒定.北京:人民衛(wèi)生出版社,2012:4-5.

30 Eddy S R.Profile Hidden Markov Models.Bioinformatics,1998,14:755-763.

31 Koetschan C,Hackl T,Müller T,et al.ITS2 database IV:Interactive Taxon Sampling for Internal Transcribed Spacer 2 based Phylogenies.Mol Phylogenet Evol,2012,63:585-588.

32 Keller A,Schleicher T,Schultz J,et al.5.8 S-28S rRNA Interaction and HMM-based ITS2 Annotation.Gene,2009,430:50-57.

33 Tamura K,Peterson D,Peterson N,et al.MEGA5:Molecular Evolutionary Genetic Analysis using Maximum Likelihood,Evolutionary Distance,and Maximum Parsimony Methods.Mol Biol Evol，2011(28):2731-2739.

34 Li X,Yang Y,Henry R J,et al.Plant DNA Barcoding:From Gene to Genome.Biol Rev Camb Philos Soc,2014:12104.