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    白喉毒素突變體CRM197在大腸桿菌中的高效可溶表達、純化及免疫原性分析

    2018-05-10 09:31:28房婷陶正紅劉艷紅于長明職睿智于蕊
    生物工程學報 2018年4期
    關(guān)鍵詞:類毒素白喉滴度

    房婷,陶正紅,劉艷紅,于長明,職睿智,于蕊

    1軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所,北京 100071

    2北京城市學院 生物醫(yī)藥學部,北京 100083

    CRM197蛋白是白喉毒素 (Diphtheria toxin,DT)的突變體,由于其第52位氨基酸Gly突變?yōu)镚lu,使其喪失了ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性,從而失去細胞毒性[1]。但CRM197仍然具有DT的完整功能結(jié)構(gòu),從而保留其免疫原性,且不存在傳統(tǒng)白喉類毒素制備需要甲醛脫毒處理、組分不均一以及可能恢復毒性等缺點,而有望成為重組白喉疫苗的有效成分[2-3]。此外CRM197可以作為多糖疫苗的載體蛋白,能有效提高多糖抗原的免疫原性,而廣泛用于疫苗開發(fā)領(lǐng)域[4-6]。目前已有多種以CRM197為載體的多糖疫苗上市,包括武田B型流感嗜血桿菌 (Hib)疫苗VaxemHibTTM(Takeda)、C群腦膜炎疫苗MeningitecTM和MenjugateTM(Nuron)、四價腦膜炎球菌ACWY多糖結(jié)合疫苗MenveoTM(Nuron)以及針對肺炎球菌的7價疫苗PrevnarTM和13價疫苗Prevnar 13TM(Pfizer)。同時有研究發(fā)現(xiàn)CRM197具有抑制腫瘤細胞增殖和遷移的作用,可作為腫瘤抑制劑開發(fā)為新型抗腫瘤藥物[7-9]。

    本研究通過對CRM197的序列進行優(yōu)化,實現(xiàn)了目的蛋白在大腸桿菌中無標簽、高效、可溶表達。通過對純化步驟進行一系列的摸索與優(yōu)化,搭建了可以工業(yè)放大的快速純化體系,并對其毒性和免疫原性開展了初步研究,為該蛋白的進一步應(yīng)用打下了堅實的基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株和質(zhì)粒

    質(zhì)粒pET-32a(+)購自Novagen公司。感受態(tài)細菌Escherichia coliTop10、E.coliBL21(DE3)購自天根公司。

    1.1.2 主要材料和儀器

    限制性內(nèi)切酶購自NEB公司;Pyrobest DNA聚合酶、ExTaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶等購自TaKaRa公司;質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司。PageRuler Prestained Protein Ladder購自Thermo公司。蛋白Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。化學發(fā)光試劑盒購自Millipore公司。兔抗白喉類毒素多克隆抗體和HRP標記羊抗兔IgG購自Abcam公司。

    HiTrap Q Sepharose FF預裝柱 (CV=5 mL)、HiTrap Heparin HP預裝柱 (CV=5 mL)、HiPrep 26/10 Desalting預裝柱 (CV=53 mL)均購于GE Healthcare公司。酵母提取物、胰蛋白胨為OXOID公司產(chǎn)品,其余為國產(chǎn)或進口分析純試劑。

    低溫高速離心機購自Beckman Coulter公司。SDS-PAGE電泳儀為BIO-RAD公司產(chǎn)品。Image Quant LAS 4000 mini成像系統(tǒng)和純化儀?KTA avant均為GE Healthcare公司產(chǎn)品。酶標儀Spectra Max Paradigm為Molecular Devices公司產(chǎn)品。

    1.1.3 實驗動物

    6–8周齡雌性 BALB/c小鼠來自本院實驗動物中心。

    1.2 方法

    1.2.1 CRM197的序列優(yōu)化

    根據(jù)白喉毒素序列 (GenBank Accession No.K01722.1),分析編碼CRM197的序列進行優(yōu)化。用大腸桿菌常用密碼子替換稀有密碼子,并平衡A、T、G、C四種堿基的比例和分布。在CRM197序列的5′端和3′端分別加入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點,并在起始密碼子前加入UAA終止密碼子以終止載體pET32a(+)上Trx蛋白的表達,委托北京博邁德基因技術(shù)有限公司進行全基因合成。

    1.2.2 CRM197表達載體構(gòu)建

    將優(yōu)化合成后的CRM197基因用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后,連接入同樣雙酶切后的表達載體pET32a(+)上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α,37℃培養(yǎng)過夜。次日挑取單克隆于5 mL LB(Amp+)培養(yǎng)基中,37℃、220 r/min培養(yǎng)12 h,提取質(zhì)粒,EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定目的基因的插入,并送測序。測序正確的質(zhì)粒命名為pET32a(+)-CRM197。

    1.2.3 CRM197在大腸桿菌中的表達

    將重組表達質(zhì)粒pET32a(+)-CRM197轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliBL21(DE3),挑取單克隆于5 mL LB(Amp+)液體培養(yǎng)基中,37℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600≈0.6時,加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG,28℃、220 r/min繼續(xù)培養(yǎng) 6 h。6163 r/min、4℃離心收集菌體,用PBS重懸后超聲碎菌。12000 r/min、4℃離心取上清,進行SDS-PAGE,以空載體表達產(chǎn)物為對照,鑒定CRM197蛋白的表達情況。

    1.2.4 Westem blotting鑒定

    將含有CRM197蛋白的超聲碎菌上清及空載體碎菌上清進行SDS-PAGE后,蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,用含3%BSA的PBST室溫封閉1 h后,加入1︰1000稀釋的兔抗白喉類毒素多克隆抗體,37℃反應(yīng)1 h。將膜用PBST洗滌4遍后,加入1︰5000稀釋的辣根酶標記的羊抗鼠IgG二抗,37℃反應(yīng)1 h后PBST洗滌4遍,采用化學發(fā)光法顯色、壓片和曝光。

    1.2.5 CRM197陰離子交換

    將pET32a(+)-CRM197/BL21(DE3)按上述發(fā)酵條件擴大培養(yǎng)到1 L,收集菌體,按菌體濕重 (g)與緩沖液體積 (mL)為1︰20重懸于緩沖液A(20 mmol/L Tris,0.5 mmol/L EDTA,5%甘油,pH 8.0)。超聲破菌后,4℃、12000 r/min離心20 min收集上清。采用HiTrap Q Sepharose FF預裝柱(CV=5 mL),流速為5 mL/min,緩沖液A平衡5 CV后上樣,收集流穿,緩沖液B(20 mmol/LTris,1 mol/L NaCl,pH 8.0)100%緩沖液B、10 CV,洗脫雜蛋白。

    1.2.6 肝素親和層析

    采用肝素親和層析柱HiTrap Heparin HP預裝柱(CV=5 mL)對樣品進行精純,緩沖液C(20 mmol/L Tris,pH 8.0)、緩沖液 D(20 mmol/L Tris,1 mol/L NaCl,pH 8.0),流速為5 mL/min,梯度洗脫,60%D、10 CV收集目的蛋白峰。

    1.2.7 脫鹽換液

    采用HiPrep26/10Desalting預裝柱 (CV=53 mL),緩沖液E(20 mmol/L PB,0.15 mol/L NaCl,pH 7.2),流速為15 mL/min,每次上樣量15 mL,更換緩沖液,收集目的蛋白。

    1.2.8 毒性試驗

    將Vero細胞消化后進行細胞計數(shù),調(diào)整細胞濃度為1.25×105個細胞/mL,將細胞懸液加入到96孔培養(yǎng)板中,100 μL/孔。白喉毒素首孔從5 ng/mL開始倍比稀釋,依次加入到含有細胞的培養(yǎng)板中,100 μL/孔;白喉類毒素和CRM197蛋白首孔從0.25 mg/mL開始倍比稀釋,依次加入到含有細胞的培養(yǎng)板中,100 μL/孔。加入毒素、類毒素和CRM197蛋白的Vero細胞培養(yǎng)板繼續(xù)于37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)6–7 d,采用MTT法觀察細胞的存活情況,用酶標儀在490 nm測定吸光值,參比波長620 nm。用GraphPad Prism 5.01軟件計算各組的 IC50。

    1.2.9 免疫原性檢測

    將不同劑量的CRM197蛋白2 μg/只和20 μg/只,采用腹部皮下方式免疫6?8周齡BALB/c小鼠,每3周免疫1次,共免疫3次,均采用氫氧化鋁佐劑,每次免疫后3周、下一次免疫前取血檢測血清中的抗體滴度;抗體滴度的測定采用ELISA的方法,白喉類毒素2 μg/mL,100 μL/孔包被96孔酶聯(lián)板,4℃包被過夜。PBST洗滌4次,5 min/次。將抗血清用PBST從1:100依次倍比稀釋后,加入酶聯(lián)板中,37℃反應(yīng)1 h,同時設(shè)PBS免疫后的血清為對照。PBST洗滌4次,5 min/次。加入HRP-抗小鼠二抗,37℃反應(yīng)30?40 min。加入TMB顯色液,50 μL/孔,顯色后用2 mol/L H2SO4終止,酶標儀450 nm測定光吸收值。以加入陰性對照血清孔的顯色值為對照,以O(shè)D450大于0.1且高于陰性孔2倍為陽性稀釋滴度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 CRM197序列優(yōu)化及載體構(gòu)建

    構(gòu)建CRM197表達載體pET32a(+)-CRM197(圖 1)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定,結(jié)果顯示,該重組質(zhì)粒酶切后產(chǎn)生一條約1600 bp的條帶 (圖1B箭頭所示),與目的基因片段大小一致,測序結(jié)果 (序列略)表明此片段與設(shè)計的CRM197基因序列完全相同。

    2.2 可溶性表達分析

    將構(gòu)建好的質(zhì)粒pET32a(+)-CRM197轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導表達,收集菌體超聲后,取上清,以空白載體為對照進行SDS-PAGE和Westem blotting鑒定。從圖2可以看出,與空載體對照相比,轉(zhuǎn)化有pET32a(+)-CRM197質(zhì)粒的菌株在58 kDa左右有明顯的條帶。Westem blotting結(jié)果證實該蛋白可與鼠抗白喉類毒素多克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合。目的條帶用凝膠灰度掃描顯示重組蛋白可占菌體總蛋白的40%以上,說明CRM197蛋白在大腸桿菌中得到了高效可溶性表達。

    圖1 CRM197表達載體的構(gòu)建及酶切鑒定Fig.1 Construction and characterization of CRM197 expression plasmid.(A)Diagram of pET32a(+)-CRM197 expression plasmid.(B)Restriction map of recombinant plasmid.1:DNA marker(DL2000);2,3:pET32a(+)-CRM197 digested by XhoⅠ/EcoRⅠ;4:DNA marker(DL15000).

    圖2 表達蛋白CRM197的SDS-PAGE和Westem blotting分析Fig.2 SDS-PAGE and Westem blotting analysis of expression protein.1:marker;2,4:the blank vector;3,5:the supernatant after homogenate and centrifuge.

    2.3 重組CRM197蛋白的純化及鑒定

    從圖3可以看出,目的蛋白基本在超聲上清中,為可溶表達,且表達量較高占比為40%。首先通過QFF一步流穿快速去除雜蛋白,隨后無需更換緩沖液,正確折疊的目的蛋白能與Heparin特異性結(jié)合,并且通過梯度洗脫進一步去除痕量雜質(zhì),最后通過脫鹽換液將蛋白置換到保存溶液PBS中,經(jīng)過三步純化后,無標簽的目的蛋白得到了很好的純化,純度可達95%以上。

    圖3 純化CRM197各步驟的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE of CRM197’s purification of each step.1:marker;2:the precipitation after ultrasonic cytolysis and centrifuge; 3: the supernatant after ultrasonic cytolysis and centrifuge;4:the flow-through collection of QFF;5:the fraction collection of Heparin HP;6:the fraction collection of desalting.

    2.4 重組CRM197蛋白的毒性試驗

    根據(jù)加入毒素、類毒素和CRM197蛋白的Vero細胞的存活情況 (圖4),計算IC50值分別為0.012 ng/mL、26.46 μg/mL 和 254.50 μg/mL??梢钥闯?,CRM197的IC50值是白喉毒素IC50值的2.1×107倍;與白喉類毒素相比,CRM197的IC50值是前者的9.6倍。以上結(jié)果說明CRM197在細胞實驗水平上是安全無毒性的。

    2.5 抗原在小鼠體內(nèi)的免疫原性分析

    分別采用高劑量 (20 μg)和低劑量 (2 μg)免疫BALB/c小鼠,每兩周免1次,共免3次。從圖5中可以看出,2 μg和20 μg組的CRM197均可誘導小鼠產(chǎn)生較高的抗體滴度,且在第9周抗體滴度達到峰值,達1︰409600,并且2 μg組三免后的抗體滴度與20 μg組的相當。

    3 討論

    自19世紀80年代以來,結(jié)合疫苗的發(fā)展大大降低了包括Hib、肺炎支原體和腦膜炎奈瑟氏球菌等導致的相關(guān)兒科疾病的發(fā)病率[10]。其中白喉類毒素、破傷風類毒素和CRM197是目前已獲批上市疫苗中使用最多的載體。有實驗表明,使用CRM197作為載體蛋白的結(jié)合疫苗,除了能有效激發(fā)受體產(chǎn)生針對結(jié)合物的抗體外,還能產(chǎn)生足夠針對白喉毒素的抗體[11-14]。并且在上述3種載體蛋白存在預存免疫的情況下,CRM197能更加有效地激發(fā)小鼠產(chǎn)生特異的針對結(jié)合物的抗體[15],這對于已接種破傷風和白喉疫苗的人群具有一定的參考意義。隨著研究手段的進步,進一步拓寬了CRM197作為載體蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域,除了與傳統(tǒng)的多糖結(jié)合外,還可與半合成糖進行綴合,進而提升13價肺炎疫苗的功效,或利用CRM197能與白喉毒素受體 (Diphtheria toxin receptor,DTR)結(jié)合通過血腦屏障的特性,與納米粒子相結(jié)合,開發(fā)針對阿爾茨海默病的治療藥物[16-18]。

    圖4 細胞毒性試驗 (MTT)Fig.4 Cytotoxicity test(MTT).

    圖5 免疫后小鼠血清中的抗體滴度Fig.5 Serum IgG titer in mouse serum after immunization.

    目前CRM197以及其他非毒突變體一般采用溶原化的白喉桿菌分泌產(chǎn)生,該菌株經(jīng)由β噬菌體感染含有編碼DT的tox突變基因[19-20]。該系統(tǒng)的優(yōu)點是目的蛋白以分泌形式表達于胞外,雜蛋白含量低有利于純化生產(chǎn)。缺點是白喉桿菌發(fā)酵條件嚴苛,且培養(yǎng)基成分復雜、價格昂貴[21-22]。采用大腸桿菌表達系統(tǒng),具有生產(chǎn)周期短、成本低、外源DNA易于導入、外源蛋白表達簡易和能很快產(chǎn)生大量的目的蛋白等優(yōu)點,是表達重組蛋白優(yōu)先選用的系統(tǒng)。但目前采用該系統(tǒng)表達CRM197存在缺陷,即目的蛋白以包涵體的形式存在,需要經(jīng)過變性、復性的階段,不利于產(chǎn)量的提高和生產(chǎn)放大,且攜帶標簽需要后續(xù)處理步驟,為產(chǎn)品質(zhì)控增加風險[23-24]。本研究對原有序列進行了優(yōu)化,采用大腸桿菌常用密碼子替換稀有密碼子,并平衡A、T、G、C四種堿基的比例和分布,優(yōu)化后重組CRM197在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得了可溶性高表達,目的蛋白約占碎菌上清總蛋白的40%,克服了上述表達體系的缺點,實現(xiàn)了目的蛋白的高效、可溶表達,且無標簽無需后續(xù)去除步驟。

    目的蛋白獲得表達后,我們又對純化流程進行了摸索。通過研究發(fā)現(xiàn),CRM197具有與天然的DT對DTR相似的親和力。而DTR的氨基酸序列與肝素結(jié)合表皮生長因子前體 (pro-HB-EGF)的相同[25]。因此推斷,正確折疊的CRM197能與Heparin柱特異結(jié)合,經(jīng)過一系列的條件摸索,最終確定了陰離子柱流穿、肝素親和柱梯度洗脫、脫鹽柱換液的快速純化流程,獲得了無細胞毒性、能誘導小鼠產(chǎn)生較高抗體滴度的目的蛋白,為后續(xù)工藝放大、工業(yè)生產(chǎn)奠定了堅實的基礎(chǔ)。

    [1]Br?ker M,Costantino P,DeTora L, et al.Biochemical and biological characteristics of cross-reacting material 197(CRM197),a non-toxic mutant of diphtheria toxin:use as a conjugation protein in vaccines and otherpotentialclinical applications.Biologicals,2011,39(4):195–204.

    [2]Br?ker M,Berti F,Costantino P.Factors contributing to the immunogenicity of meningococcal conjugate vaccines.Hum Vaccin Immunother,2016,12(7):1808–1824.

    [3]Podda A,Vescia N,Donati D,et al.A phase-I clinicaltrialofanew antitetanus/antidiphtheria vaccine for adults.Ann Ig,1991,3(2):79–84.

    [4]Br?ker M,Berti F,Schneider J,et al.Polysaccharide conjugate vaccine protein carriers as a“neglected valency”-potential and limitations.Vaccine,2017,35(25):3286–3294.

    [5]Romaniuk SI,Kolibo DB,Komisarenko SV.Perspectives of application of recombinant diphtheria toxin derivatives. Bioorg Khim, 2012, 38(6):639–652.

    [6]Pappenheimer AM Jr,Uchida T,Harper AA.An immunological study of the diphtheria toxin molecule.Immunochemistry,1972,9(9):891–906,IN5-IN6.

    [7]Buzzi S,Rubboli D,Buzzi G,et al.CRM197(nontoxic diphtheria toxin):effects on advanced cancer patients.Cancer Immunol Immunother,2004,53(11):1041–1048.

    [8]Fiorentini G,Banfi R,Dentico P,et al.Clinical experience of treatment of metastatic melanoma and solid tumours adopting a derivative of diphtheria toxin:cross-reacting material 197.In vivo,2013,27(2):197–202.

    [9]DateokaS,OhnishiY,Kakudo K.Effectsof CRM197,a specific inhibitor of HB-EGF,in oral cancer.Med Mol Morphol,2012,45(2):91–97.

    [10]Shinefield HR.Overview of the development and currentuse ofCRM197conjugate vaccines for pediatric use.Vaccine,2010,28(27):4335–4339.

    [11]Halperin SA,McDonald J,Samson L,etal.Simultaneous administration of meningococcal C conjugatevaccineand diphtheria-tetanus-acellular pertussis-inactivated poliovirus-Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine in children:a randomized double-blind study.Clin Invest Med,2002,25(6):243–251.

    [12]Gasparini R,Conversano M,Bona G,et al.Randomized trial on the safety,tolerability,and immunogenicity of MenACWY-CRM,an investigationalquadrivalent meningococcal glycoconjugate vaccine,administered concomitantly with a combined tetanus,reduced diphtheria, and acellular pertussis vaccine in adolescents and young adults.Clin Vaccine Immunol,2010,17(4):537–544.

    [13]McVernon J,MacLennan J,Clutterbuck E,et al.Effect of infant immunisation with meningococcus serogroup C-CRM197conjugate vaccine on diphtheria immunity andreactogenicity inpre-schoolaged children.Vaccine,2003,21(19/20):2573–2579.

    [14]Tashani M,Alfelali M,Barasheed O,et al.Effect of Tdap when administered before,with or after the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine(coadministered with the quadrivalent meningococcal conjugate vaccine)in adults:a randomised controlled trial.Vaccine,2016,34(48):5929–5937.

    [15]Tontini M,Berti F,Romano MR,et al.Comparison of CRM197,diphtheria toxoid and tetanus toxoid as protein carriers for meningococcal glycoconjugate vaccines.Vaccine,2013,31(42):4827–4833.

    [16]M?ginger U,Resemann A,Martin CE,et al.Cross reactive material 197 glycoconjugate vaccines contain privileged conjugation sites.Sci Rep,2016,6:20488.

    [17]Parameswarappa SG,Reppe K,Geissner A,et al.A semi-synthetic oligosaccharide conjugate vaccine candidate confers protection againstStreptococcus pneumoniaeSerotype 3 infection.Cell Chem Biol,2016,23(11):1407–1416.

    [18]Kuo YC,Rajesh R.Targeted delivery of rosmarinic acid across the blood-brain barrier for neuronal rescueusing polyacrylamide-chitosan-poly(lactideco-glycolide) nanoparticles with surface cross-reacting material 197 and apolipoprotein E.Int J Pharm,2017,528(1/2):228–241.

    [19]Rappuoli R. Isolation and characterization ofCorynebacteriumdiphtheriaenontandem double lysogens hyperproducing CRM197.Appl Environ Microbiol,1983,46(3):560–564.

    [20]Rappuoli R,Michel JL,Murphy JR.Integration of corynebacteriophagesandinto two attachment sites on theCorynebacterium diphtheriaechromosome.J Bacteriol,1983,153(3):1202–1210.

    [21]Cox JC.New method for the large-scale preparation of diphtheria toxoid:purification of toxin.Appl Microbiol,1975,29(4):464–468.

    [22]Fass R,Bahar S,Kaufman J,et al.High-yield production of diphtheria toxin mutants by high-density culture of C7(β)tox+strains grown in a non-deferrated medium.Appl Microbiol Biotechnol,1995,43(1):83–88.

    [23]Stefan A,Conti M,Rubboli D,et al.Overexpression and purification of the recombinant diphtheria toxin variant CRM197 inEscherichia coli.J Biotechnol,2011,156(4):245–252.

    [24]Bishai WR,Rappuoli R,Murphy JR.High-level expression of a proteolytically sensitive diphtheria toxin fragment inEscherichia coli.J Bacteriol,1987,169(11):5140–5151.

    [25]Mitamura T, Umata T, Nakano F, et al.Structure-function analysis of the diphtheria toxin receptor toxin binding site by site-directed mutagenesis.J Biol Chem,1997,272(43):27084–27090.

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