洋蔥CMS-T型育性分子標(biāo)記的篩選與鑒定

潘美紅，楊海峰，惠林沖，薛 萍，張新圣，繆美華，陳振泰

(連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇連云港 222000)

洋蔥(AlliumcepaL.)屬單子葉天門冬目(Asparagale)百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)的重要園藝作物[1]，已有4 000多年的栽培歷史，被世界各地廣泛栽培[2]。聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織2012調(diào)查數(shù)據(jù)顯示：中國是生產(chǎn)洋蔥最多的國家，達(dá)到2.05×107t[3]，主要用于外貿(mào)出口和國內(nèi)消費(fèi)。目前國內(nèi)洋蔥雜交種主要以進(jìn)口日本和韓國為主，缺乏自主雜交品種。

洋蔥是2 a生植物，在雜交育種中，1個(gè)世代需跨越3個(gè)年份，異花授粉，傘狀花序，花小，結(jié)籽率低，人工去雄困難，所以利用洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS，cytoplasmic male sterility)系選育雜交種尤為重要。首次報(bào)道在洋蔥品種‘Italian Red’[4]和‘Jaune paille des Vertus’[5]中分別發(fā)現(xiàn)CMS-S和CMS-T 2種細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型。利用現(xiàn)代DNA分子標(biāo)記技術(shù)，PCR擴(kuò)增能夠快速鑒定洋蔥雄性細(xì)胞質(zhì)不育類型；Sato[6]利用cob標(biāo)記能夠區(qū)分CMS-S型，而不能區(qū)分正?？捎?N)和CMS-T；Engelke等[7]利用 orfA501標(biāo)記在洋蔥不育株中擴(kuò)增出473 bp條帶，可育株沒有或很弱，與cob標(biāo)記相結(jié)合區(qū)分洋蔥可育株N、CMS-S和CMS-T，陳沁濱等[8]和吳海濤等[9]利用此標(biāo)記將洋蔥材料101A鑒定為CMS-S和將8A鑒定為CMS-T。Havey[10]在洋蔥葉綠體DNA中開發(fā)出Cp-cytotype標(biāo)記，Kim等[11]利用線粒體DNA中的cob-type2和 atp6標(biāo)記都能將CMS-S型鑒定，但不能區(qū)分正?？捎闚和CMS-T，而Kim等[12]利用洋蔥線粒體DNA中相關(guān)細(xì)胞色素c氧化酶亞基I(coxI，cytochromecoxidase subunit I)基因，該基因連接到洋蔥 orfA501同系物序列上，與韭菜 orfA501序列相比，其含有 atp9基因的5’序列，由coxI和 orfA501同源物組成2 175 bp連續(xù)開放閱讀框的嵌合序列，并開發(fā)出新的標(biāo)記命名為 orf725，能夠?qū)⒀笫[3種類型完全區(qū)分開。洋蔥的細(xì)胞質(zhì)雄性不育表現(xiàn)為母系遺傳，主要是由線粒體和葉綠體基因中片段差異造成的[13-14]。目前，針對洋蔥的N、CMS-S和CMS-T 3種類型葉綠體DNA基因組已公布，研究表明，可育株N(GenBank數(shù)據(jù)中登錄號：KM088013，下同)和CMS-S(KM088014)核苷酸之間有352個(gè)SNPs和141處片段插入或缺失，多態(tài)性豐富，而N和CMS-T(KM088015)核苷酸之間有4個(gè)SNPs和2處片段插入，根據(jù)petN和psbM基因之間的差異，設(shè)計(jì)Cpp1分子標(biāo)記，能夠利用簡單的PCR將洋蔥的N、CMS-S和CMS-T 3種類型完全區(qū)分開[15]。隨后Kim等[16]發(fā)表洋蔥CMS-S線粒體DNA基因組，序列全長316 363 bp，GenBank數(shù)據(jù)中登錄號：KU318712。洋蔥葉綠體和線粒體DNA基因組的公開發(fā)表，將更有利于洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育機(jī)制的研究。

國外已經(jīng)利用恢復(fù)基因型(MsMs)、保持系(msms)和不育系(msms)生產(chǎn)洋蔥F1雜交種。洋蔥不育株可以通過有無花粉判斷，而保持系則需要不斷地雜交、回交來選擇，其隨機(jī)性大、選育周期長。近年來，RAPD[17]、RFLP[18]、AFLP等[19]分子標(biāo)記研究洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育和可育材料的多態(tài)性，并開發(fā)鑒定洋蔥育性遺傳位點(diǎn)的分子標(biāo)記。Jones等[4]研究認(rèn)為CMS-S不育由1對隱性細(xì)胞核基因(msms)控制，而Schweisguth[20]認(rèn)為CMS-T可能是3個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞核基因共同控制，雜交后代分離比較復(fù)雜，Kim[21]認(rèn)為洋蔥2種不育類型都是由單核基因Ms位點(diǎn)控制，開發(fā)出jnurf13分子標(biāo)記，適合CMS-S和CMS-T 2種類型，并且與Ms位點(diǎn)緊密連鎖。所以，通過開發(fā)分子標(biāo)記鑒定純合的恢復(fù)基因型(MsMs)、保持系(msms)和不育系(msms)的基因型對雜交制種尤為重要，能夠顯著縮短育種年限和減少工作量。目前，國內(nèi)洋蔥雜交種生產(chǎn)相關(guān)報(bào)道很少，尤其是中日照洋蔥品種。本試驗(yàn)擬用cob(s)、cob(n)、 orfA501、Cpp1、 orf725 、jnurf13、AcSKP1、DNF-566、RNS-357、OPT和PsaO共11個(gè)與洋蔥育性相關(guān)的分子標(biāo)記，對連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜課題組(以下簡稱本課題組)選育的洋蔥不育系材料進(jìn)行驗(yàn)證，篩選出簡單、高效的分子標(biāo)記，為洋蔥育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

洋蔥試驗(yàn)材料的生態(tài)類型為中日照，全部來自于連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究室，共34份，分別編號為1～34號，供試材料名稱和特點(diǎn)見表1，D9和d9、A1和a1、A3和a3、A-2和a-2、A-3和a-3、T和t分別為相配套的不育系和保持系，6套不育系材料引種名稱、來源、單位和時(shí)間見表2，其中D9和d9、A1和a1為2套穩(wěn)定的不育系。表1中13號材料是母本黃皮不育株A-2與父本紅皮保持株t雜交的粉皮F1(A-2×t)，14號是母本粉皮不育株13號與父本紅皮保持系t進(jìn)行回交的紅皮BC1[(A-2×t)×t]。紅皮洋蔥材料406中篩選出4株不育株，并與406材料中可育株t2、t5、t6、t11分別進(jìn)行雜交獲得F1，分別命名為T-2-2、T-1-5、T-2-6和T-7-11；同時(shí)對可育株t2、t5、t6、t11進(jìn)行自交獲得F1，即表1中t-2、t-5、t-6和t-11；512、728、562、B1、H1、911、930、932和948為常規(guī)資源材料；T8×512、T10×728、T2×562 3份 材料為雜交種F1。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)材料在連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜試驗(yàn)基地種植，1～14號材料在開花期分別取其1～2片嫩葉，并調(diào)查統(tǒng)計(jì)是否有花粉，套袋自交，15～34號為隨機(jī)選取的洋蔥鱗莖球，取5～10 g鱗莖片，液氮保存，用北京天根DNA試劑盒(型號：DP350-03)提取洋蔥基因組DNA，引物由蘇州金唯智生物有限公司合成(表3)，PCR擴(kuò)增試劑購置于TAKARA公司，反應(yīng)體系為25 μL，包括：2 μL DNA(0.1 μg)，2.5 μL 10× PCR buffer，1.25 μL(10 μmol/L)正向引物，1.25 μL(10 μmol/L)反向引物，2 μL dNTPs(10 mmol/L)，0.25 μLTaq酶和15.8 mL ddH2O。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min[22]，AcSKP1采用MK886、MK898、MK620、和MK628四對引物混合PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件參考Huo等[23]，jnurf13的PCR反應(yīng)條件參考Kim[21]的方法。cob(s)、cob(n)、 orfA501、 orf725、DNF-566和RNS-357的PCR產(chǎn)物采用質(zhì)量濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測，Cpp1、jnurf13、AcSKP1、OPT和PsaO的PCR產(chǎn)物采用8%的聚丙烯酰氨凝膠(464 mL/L H2O，250 mL/L 1 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)，266 mL/L 30% Acrylamide，10 mL/L 10% SDS，10 mL/L 10%(NH4)2S2O8，0.6 mL/L TEMED)電泳檢測，電壓100 V，電泳3 h，硝酸銀染色，采用佳能EOS6D相機(jī)在膠片燈上拍照記錄。

表1 供試洋蔥材料編號、株系及特點(diǎn)Table 1 Code,lines and characteristics of tested onion materials

表2 洋蔥6份不育材料來源及關(guān)系Table 2 Sources and relationship of six onion materials

表3 洋蔥分子標(biāo)記引物Table 3 Primer sequences of molecular markers in onion

2 結(jié)果與分析

2.1 洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型鑒定

2.1.1 洋蔥不育株表型觀察 當(dāng)洋蔥傘狀花序上的花朵開裂達(dá)到40%～ 60%時(shí)，觀察結(jié)果顯示，正?？捎昊ǘ渲行廴镲枬M，花藥和花粉囊開裂后能夠正常彈出花粉(圖1-A)，且套袋自交后能夠正常結(jié)籽。洋蔥的不育株花朵開裂后，雄蕊較弱，花藥在發(fā)育過程中漸漸萎縮干枯，無花粉粒彈出，套袋自交不結(jié)籽(圖1-B)。對洋蔥材料1～14 號進(jìn)行表型觀察和套袋后，1～6號洋蔥花藥有花粉彈出，套袋自交結(jié)籽，說明是可育株；7～14 號洋蔥花藥無花粉彈出，套袋自交未結(jié)籽，說明是不育株。

圖1 洋蔥可育株(A)和不育株(B)花序形態(tài)特性Fig.1 Morphological characteristics of fertile flowers (A) and sterile flowers (B)

2.1.2 洋蔥不育類型鑒定 采用cob標(biāo)記對1～14 號洋蔥材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，cob(s)標(biāo)記結(jié)果顯示在414 bp大小處沒有條帶或很弱，初步說明1～14號都不是S型不育(圖2-A)，而cob(n)標(biāo)記結(jié)果顯示只在180 bp大小處條帶很亮，說明1～14 號是可育或T型細(xì)胞質(zhì)不育；用 orfA501標(biāo)記引物只能在不育系中擴(kuò)增出473 bp大小的條帶,而可育系中沒有或者很弱，結(jié)果顯示1～6號沒有條帶或很弱，而7～14號擴(kuò)增出473 bp，條帶清晰，結(jié)果與Sato等[6]和Engelke等[7]報(bào)道一致，以上分子標(biāo)記結(jié)果表明：洋蔥材料1～6 號是可育株，7～14號為CMS-T不育株。 orf725[12]能夠在可育株中擴(kuò)增出1條833 bp的條帶，T型中擴(kuò)增出833 bp和628 bp 2條帶，而在S型中只能擴(kuò)增出1條628 bp的條帶，結(jié)果顯示本試驗(yàn)材料1～6號PCR擴(kuò)增出1條帶，說明是可育株，7～ 14號擴(kuò)增出2條帶，為CMS-T型不育株。Cpp1[15]標(biāo)記是根據(jù)洋蔥葉綠體基因組DNA核苷酸序列的差異開發(fā)出的標(biāo)記，能夠在可育株中擴(kuò)增出1條264 bp的條帶，T型中擴(kuò)增出1條307 bp的條帶，而在S型中擴(kuò)增出1條254 bp的條帶，由于3條帶大小差異只有10～53 bp，PCR產(chǎn)物采用聚丙烯酰氨凝膠電泳(PAGE)檢測，從圖2-E中看出1條307 bp很亮的條帶和1條264 bp亮度較弱的條帶，不能有效區(qū)分本試驗(yàn)材料的不育類型。

株系1 Breeding lines 1.d9；2.a3；3.a-3；4.a1；5.t；6.a-2；7.D9；8.A3；9.A-3；10.A1；11.T；12.A-2；13.A-2×t；14.(A-2×t)×t；A.cob(s)；B.cob(n)；C. orfA501；D. orf725；E.Cpp1

圖2不同引物對洋蔥不育類型鑒定
Fig.2Identificationofonionsteriletypewithdifferentprimers

2.2 洋蔥育性恢復(fù)基因型(Ms)驗(yàn)證

本課題組早期通過傳統(tǒng)的雜交、回交在洋蔥同一品種中篩選出穩(wěn)定的保持系和不育系d9和D9、a1和A1，選用前人報(bào)道的DNF-566、RNS-357、jnurf13、PsaO、OPT和SKP1[23](MK886、MK898、MK620、MK628)共6個(gè)分子標(biāo)記對1～34號材料進(jìn)行驗(yàn)證，DNF-566標(biāo)記能夠在含有Ms位點(diǎn)中擴(kuò)增出556 bp，RNS-357標(biāo)記只在含有ms位點(diǎn)的洋蔥中擴(kuò)增出1條357 bp的條帶，而含有Msms中能同時(shí)擴(kuò)增出2條帶。結(jié)果表明1～4、6～19、23、28、29、31和33號材料顯示只有1條357 bp的條帶，說明該材料基因型為msms；21、24和26號擴(kuò)增出1條566 bp的條帶，基因型為MsMs；22、25、30、32和34號擴(kuò)增出2條帶，其中25和32號2條帶較弱，基因型為Msms；而5、20和27 3個(gè)材料2個(gè)標(biāo)記均無條帶(圖3-A和圖3-B)。

OPT標(biāo)記能夠在含有Ms位點(diǎn)中擴(kuò)增出1條659 bp的條帶，在含有ms位點(diǎn)中擴(kuò)增出1條357 bp的條帶，而含有Msms中能同時(shí)擴(kuò)增出2條帶，同樣PsaO能夠在含有Ms位點(diǎn)中擴(kuò)增出1條490 bp的條帶，在含有ms位點(diǎn)中擴(kuò)增出1條437 bp的條帶，而含有Msms中能擴(kuò)增出2條帶。結(jié)果顯示OPT分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與PsaO分子標(biāo)記互相矛盾，如11、14、22和24號，OPT標(biāo)記鑒定為MsMs，而PsaO鑒定為Msms；16、27、30、31和34號，OPT標(biāo)記鑒定為Msms，而PsaO鑒定為MsMs；2個(gè)分子標(biāo)記鑒定結(jié)果相同的為5、15、20、28、29和33號，基因型為MsMs，23和25號為Msms，其他均不同(圖3-C和圖3-D)，所以，OPT和PsaO標(biāo)記不適合作為本試驗(yàn)材料的篩選Ms遺傳位點(diǎn)。

為了能夠準(zhǔn)確鑒定洋蔥可育株N、CMS-S和CMS-T 3種類型，Kim[21]報(bào)道的jnurf13分子標(biāo)記可以用于區(qū)分3種類型，能夠在含有Ms位點(diǎn)中擴(kuò)增出1條241 bp的條帶，在含有ms位點(diǎn)中擴(kuò)增出1條229 bp的條帶，而含有Msms中能擴(kuò)增出2條帶。Huo等[23]開發(fā)出的SKP1標(biāo)記能夠區(qū)分洋蔥可育株N和CMS-S 2種類型，能夠在含有Ms位點(diǎn)中擴(kuò)增出1條898 bp的條帶，在含有ms位點(diǎn)中擴(kuò)增出1條628 bp的條帶，而含有Msms中能擴(kuò)增出2條帶，但未對T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型進(jìn)行報(bào)道。本試驗(yàn)材料中包括CMS-T類型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)jnurf13和SKP1標(biāo)記的結(jié)果完全一致，2個(gè)標(biāo)記顯示7～14號基因型為msms，且為不育株，與表型觀察的結(jié)果相符合，20、21、24、26和27號5個(gè)材料基因型為MsMs，5、22、23、25、30、33和34號7個(gè)材料基因型為Msms，其他22個(gè)材料基因型為msms。對6個(gè)標(biāo)記結(jié)果分析表明，DNF-566、RNS-357、jnurf13和SKP1中7～14號符合Ms遺傳規(guī)律(表4)，基因型為純合msms不育株，初步分析表明：jnurf13和SKP1標(biāo)記適合本材料篩選Ms遺傳位點(diǎn)。

不同洋蔥材料1 Different onion materials 1.d9；2.a3；3.a-3；4.a1；5.t；6.a-2；7.D9；8.A3；9.A-3；10.A1；11.T；12.A-2；13.A-2×t；14.(A-2×t)×t；15.t-11；16.t-2；17.t-5；18.t-6；19.512；20.728；21.562；22.B1；23.H1；24.911；25.930；26.932；27.948；28.T-7-11；29.T-2-2；30.T-1-5；31.T-2-6；32.T8×512；33.T10×728；34.T2×562。A.DNF-566；B.RNS-357；C.OPT；D.PsaO；E.jnurf13；F.SPK1

圖3 洋蔥Ms位點(diǎn)分子標(biāo)記PCR驗(yàn)證Fig.3 Identification of simple PCR markers linked to the Ms locus in onion

注：A.顯性純合子(MsMs)；H.雜合子(Msms)；B.隱性純合子(msms)；D.顯隱性純合子或雜合子(MsMs，Msms，msms)。

Note:A.homozygous dominant (MsMs)； H.heterozygous (Msms)； B.homozygous recessive (msms)；D.homozygous dominant,homozygous recessive,or heterozygous(MsMs,Msms,msms).

2.3 洋蔥不同標(biāo)記實(shí)用性比較

綜合比較洋蔥不育系鑒定相關(guān)分子標(biāo)記cob(s)、cob(n)、 orfA501、 orf725和Cpp1，其中 orf725能夠簡單、快速的鑒定洋蔥N、CMS-S和CMS-T 3種類型。與洋蔥育性相關(guān)的6個(gè)分子標(biāo)記jnurf13、AcSKP1、DNF-566、RNS-357、OPT和PsaO中(表5)，其中jnurf13和AcSKP1能夠準(zhǔn)確鑒定本試驗(yàn)材料，包括CMS-T類型，AcSKP1采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用時(shí)少、速度快，但其采用混合PCR擴(kuò)增比jnurf13普通PCR擴(kuò)增所用試劑成本高，jnurf13標(biāo)記試劑成本較低，比較適合生產(chǎn)應(yīng)用。

表5 洋蔥不同標(biāo)記實(shí)用性比較分析Table 5 Comparison and analysis of different marks of onion

3 討 論

洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系是解決洋蔥雜交制種最有效的途徑之一，在生產(chǎn)實(shí)踐中，通過田間觀察，易發(fā)現(xiàn)不育株，進(jìn)一步通過分子標(biāo)記來驗(yàn)證不育類型。自Jones等[4]和Berninger等[5]報(bào)道洋蔥CMS-S和CMS-T，很多分子標(biāo)記被用來區(qū)分不育類型，Cp-cytotype[25]、cob[6]、atp6和cob-type2[11]都只能區(qū)分CMS-S型，且有的PCR擴(kuò)增后還需要進(jìn)行后續(xù)酶切反應(yīng)。orf501[7]只能區(qū)分不育和可育株，需要和上述鑒定S型的標(biāo)記聯(lián)合分析，才能將洋蔥N、CMS-S和CMS-T區(qū)分開(圖2-A、圖2-B、圖2-C)， orf725[12]和Cpp1[15]可以用簡單的PCR區(qū)分洋蔥3種類型，本試驗(yàn)材料中用 orf725分子標(biāo)記能夠區(qū)分N和CMS-T類型，與cob和orf501結(jié)果一致，而Kim等[15]利用葉綠體基因組DNA開發(fā)的Cpp1標(biāo)記能夠區(qū)分3種類型，Cpp1標(biāo)記分析130份來源于不同國家地區(qū)的栽培種，發(fā)現(xiàn)83份N型中含有54 bp的插入，與CMS-T完全一致，但無法區(qū)分N和CMS-T 2種類型。本試驗(yàn)中1～14號為N與CMS-T類型，PCR擴(kuò)增條帶大小完全一致，不能有效地進(jìn)行區(qū)分，與Kim報(bào)道結(jié)果一致，其同時(shí)提出新的模型，即正常可育株N分為N-Type1，含有43 bp插入的為N-Type2，CMS-T分為CMS-T-Type1，含有1 bp 的SNP的插入類型為CMS-T-Type2。本試驗(yàn)中的1～6號按此分類對應(yīng)是N-Type2，其他還需要進(jìn)一步測序分析。雖然洋蔥CMS-S型線粒體基因組DNA已發(fā)布，但還需要進(jìn)一步研究分析SNP三者之間的差異。比較上述分子標(biāo)記在隨機(jī)材料中驗(yàn)證不育株的類型，結(jié)果表明 orf725分子標(biāo)記最為簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用。

控制洋蔥育性相關(guān)的基因研究，最早由Jones等[4]提出CMS-S由Ms基因控制，Schweisguth等[20]認(rèn)為CMS-T由3個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞核基因共同控制，隨著分子標(biāo)記的廣泛應(yīng)用，ACms.1100[17]、jnurf05和jnurf17[26]、jnurf12和jnurf13[21]、OPT和PsaO[27]、WHR240[28]、PMS1[29]、DNF-566和RNS-357[19]、Ms[30]等與Ms位點(diǎn)相關(guān)標(biāo)記被開發(fā)應(yīng)用，12個(gè)分子標(biāo)記中，只有jnurf12和jnurf13標(biāo)記報(bào)道3種類型(N、CMS-S和CMS-T)，其他10個(gè)標(biāo)記只報(bào)道N、CMS-S 2種材料，其中ACms.1100和PMS1標(biāo)記都以‘506L’為CMS材料，并未指出S或T型，而本試驗(yàn)不育材料都為CMS-T型。ACms.1100標(biāo)記位于jnurf17和jnurf06標(biāo)記之間， jnurf12標(biāo)記沒有與任何重組體的Ms基因座完美連接，比位于0.05 cM距離的jnurf05標(biāo)記更接近于Ms基因座，然而，當(dāng)用jnurf12標(biāo)記分析不同來源的CMS-S時(shí)，標(biāo)記基因型出現(xiàn)差異。jnurf13是位于jnurf12標(biāo)記側(cè)翼的約5.5 kb序列，依據(jù)有12 bp的插入，開發(fā)設(shè)計(jì)出jnurf13分子標(biāo)記適合洋蔥3種不同類型的鑒定[21]。jnurf13分子標(biāo)記驗(yàn)證1～34號材料，7～14號為不育系，33和34號為雜交種，驗(yàn)證結(jié)果與表型完全一致，所以，本試驗(yàn)結(jié)果支持Kim提出的洋蔥3種類型(N、CMS-S和CMS-T)是由Ms位點(diǎn)控制，同時(shí)，AcSKP1分子標(biāo)記驗(yàn)證結(jié)果與jnurf13標(biāo)記完全一致，首次報(bào)道AcSKP1標(biāo)記適合本試驗(yàn)提供的細(xì)胞質(zhì)雄性不育T型。DNF-566和RNS-357標(biāo)記只能分別鑒定Ms和ms，2個(gè)標(biāo)記結(jié)合分析，5、20和27號經(jīng)重復(fù)PCR擴(kuò)增試驗(yàn)后無條帶(圖3-A、圖3-B)，排除人為操作或試劑儀器等問題，其他31份材料中，只有23、32和33號3個(gè)材料結(jié)果與jnurf13、SKP1不一致，其他完全一致，尤其是7～14號CMS-T材料，3個(gè)標(biāo)記結(jié)果完全一致，更進(jìn)一步支持Kim的觀點(diǎn)。而Huo等[27]報(bào)道的PsaO和OPT標(biāo)記，基于‘506L’和‘H6’ 2個(gè)品種的F1和F2，而對于田間隨機(jī)的CMS-S材料就不能完全適應(yīng)，發(fā)現(xiàn)2個(gè)標(biāo)記與其他3個(gè)標(biāo)記結(jié)果有很多不同之處，所以，PsaO和OPT標(biāo)記不適合作為本試驗(yàn)材料的Ms育性相關(guān)標(biāo)記的驗(yàn)證。

另外，在洋蔥中報(bào)道的標(biāo)記ACms.1100，不能確定是連鎖標(biāo)記或功能標(biāo)記[17]；WHR240標(biāo)記基于洋蔥花蕾期cDNA序列，操作繁瑣[28]；Ms標(biāo)記能夠在田間直接應(yīng)用篩選S型不育系和保持系[31]，但CMS-T是否適合并未報(bào)道。而最新研究報(bào)道基于洋蔥材料混合群體分離分析法(BSA)和轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)得到30個(gè)與Ms遺傳位點(diǎn)相關(guān)候選基因，其中14個(gè)連鎖不平衡，并對其cDNA全長測序，在可育株和不育株間進(jìn)行氨基酸比對，發(fā)現(xiàn)有4個(gè)基因的氨基酸有差異，其中的 PMS1基因組DNA中有錯(cuò)配修復(fù)，是最好的候選基因標(biāo)記，并對其進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證[29]，但是否適合本試驗(yàn)材料還需進(jìn)一步驗(yàn)證。盡管jnurf13和AcSKP1標(biāo)記適合本試驗(yàn)材料，但是從生產(chǎn)應(yīng)用選育恢復(fù)基因型(MsMs)、保持系(msms)和不育系(msms)角度考量，AcSKP1分子標(biāo)記采用的是混合PCR，試劑耗材成本相對高，而jnurf13分子標(biāo)記適用于簡單PCR驗(yàn)證，所以，jnurf13分子標(biāo)記更適合在洋蔥大田生產(chǎn)中應(yīng)用。

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