響應面試驗優(yōu)化鏈霉菌Z331-A的發(fā)酵條件

范麗霞,胡曉蘋,劉文波,RAJAOFERA Mamy Jayne Nelly,唐中發(fā),繆衛(wèi)國*

(1.海南大學 食品學院,海南 ?？?570228；2.海南大學 熱帶農林學院,海南 ?？?570228)

鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)是放線菌的一個大屬,其所產生的活性物質約占所有放線菌所產生物活性物質的2/3以上［1］。其中,鏈霉菌屬所產抗生素的產量約占微生物所產抗生素總量的70%［2］。目前,從海洋鏈霉菌中不斷有新穎的具有生物活性的化合物分離出來［3-7］,正逐漸成為研究的熱點。而且,由于鏈霉菌所產抗生素多是天然的、綠色藥劑,具有抗性機制多樣、對環(huán)境安全等特點而被廣泛關注［8］。然而,微生物源抗生素的產量低也依然是個問題,制約著抗生素的開發(fā)［9-10］。

實驗室從海南熱帶海洋的鹽堿土壤中分離出一株鏈霉菌Z331-A,具有廣譜活性,且活性穩(wěn)定,是一種極具經濟價值和開發(fā)潛力的微生物。考慮到鏈霉菌代謝產物的產量受發(fā)酵條件影響較大［11］,極其影響后期活性產物的分離及其他的開發(fā)研究,所以鏈霉菌發(fā)酵工藝的建立尤為重要。響應面法是生物研究中優(yōu)化培養(yǎng)基的重要方法,不僅能充分地反映試驗中各因素和水平的效果,直觀地分析各因素之間的交互作用,克服了正交試驗設計只能處理離散的水平值的缺陷,還能找出試驗中各因素的最佳組合并預測響應值的最優(yōu)值［12-13］。

為提高鏈霉菌Z331-A中抑菌活性物質的產量和進一步開發(fā)該菌,本研究采用響應面法對其液體發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,以期為進一步擴大培養(yǎng)、活性產物分離和應用等提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株與試劑

鏈霉菌(Streptomyces)Z331-A：分離自海南近海鹽堿性土壤,保存于海南大學食品學院微生物實驗室；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ATCC6633：廣東省微生物菌種保藏中心。

麥芽提取物、酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、可溶性淀粉、無水葡萄糖、碳酸鈣(均為生化試劑或分析純)：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；磷酸氫二鉀(分析純)：廣州化學試劑廠；結晶硫酸鎂、硝酸鉀、硫酸亞鐵、氯化鈉(均為分析純)：西隴化工股份有限公司；黃豆粉：山東朝旭食品有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基的配制

基礎培養(yǎng)基(高氏一號液體培養(yǎng)基)：可溶性淀粉20 g,硝酸鉀1 g,磷酸氫二鉀0.5 g,硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5 g,NaCl 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,水1 000 mL,pH值7.4～7.6。

發(fā)酵培養(yǎng)基：

①高氏一號液體培養(yǎng)基：同基礎培養(yǎng)基。

②ISP-2液體培養(yǎng)基：酵母提取物4 g,葡萄糖4 g,麥芽提取物10 g,碳酸鈣2 g,水1 000 mL,pH值7.4～7.6。

③黃豆粉液體培養(yǎng)基：黃豆粉40 g,蛋白胨2 g,葡萄糖20 g,水1 000 mL,pH自然。

④LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g,酵母膏5 g,NaCl 10 g,蒸餾水1 000 mL,pH7.0。

⑤馬鈴薯葡萄糖肉湯(potato dextrose broth,PDB)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g,馬鈴薯200 g,水1 000 mL,自然pH值。

⑥酵母浸出粉胨葡萄糖(yeastextractpeptonedextrose,YEPD)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g,胰蛋白胨20 g,酵母粉10 g,自來水1 000 mL,pH自然。

1.2 儀器與設備

HMS-310振蕩培養(yǎng)箱：天津恒奧科技發(fā)展有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；BCD-245D美菱冰箱：合肥美菱股份有限公司；CL-321型臺式高壓滅菌鍋：日本ALP公司；SPX-250智能生化培養(yǎng)箱：寧波海曙賽福實驗儀器廠；UV-1800紫外可見分光光度計：島津(中國)有限公司；BM340超低溫冰箱：法國Froilabo公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及發(fā)酵方法

取冷凍于甘油管的菌株Z331-A,按1%的接種量接種于裝液量為40 mL/100 mL的高氏一號液體培養(yǎng)基中,28℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)2～3 d后得到一級種子液。按3%的接種量接種到裝液量為40 mL/100 mL的高氏一號液體培養(yǎng)基中,28℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)2～3 d后得到二級種子液,再按3%的接種量接種到裝液量為40 mL/100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中,28℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)7 d,得發(fā)酵產物。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

將種子培養(yǎng)基以3%接種量接入6種常用的放線菌培養(yǎng)基中(高氏一號、黃豆粉、PDB、LB、YEPD、ISP-2液體培養(yǎng)基),28℃、180 r/min培養(yǎng)7 d,測定在不同培養(yǎng)基中發(fā)酵液對測試菌枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑大小,確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基,進行3次重復。

1.3.3 抑菌活性物質測定

菌株Z331-A經過菌種活化后發(fā)酵,發(fā)酵條件為：28℃,裝液量為40 mL/100 mL,180 r/min,培養(yǎng)7 d得發(fā)酵產物后,9 000 r/min離心、去沉淀,即獲得發(fā)酵上清液,0.22μm的濾膜過濾,即為待測無菌發(fā)酵液。

本試驗以枯草芽孢桿菌為測試菌,采用紙片擴散法,每個紙片含相應的發(fā)酵液25μL,陽性對照為黃胺藥敏紙片(300μg/片),以十字交叉法測定待測無菌發(fā)酵液對枯草芽孢桿菌的抑菌圈大小,每組3個重復。

1.3.4 單因素試驗

在其他發(fā)酵培養(yǎng)條件一致的情況下,研究發(fā)酵時間(1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d、12 d、13 d、14 d、15 d)、裝液量(10 mL/100 mL、20 mL/100 mL、30 mL/100 mL、40 mL/100 mL、50 mL/100 mL)、接種量(2%、4%、6%、8%、10%)、培養(yǎng)溫度(20℃、24℃、28℃、32℃、36℃)、搖瓶轉速(160r/min、180r/min、200r/min、220r/min、240r/min)對鏈霉菌Z331-A發(fā)酵液抑菌圈直徑大小的影響。

1.3.5 Plackett-Burman設計確定關鍵影響因素

根據單因素試驗結果,采用Plackett-Burman(PB)試驗設計以影響菌株培養(yǎng)條件的發(fā)酵時間、裝液量、接種量、搖瓶轉速、培養(yǎng)溫度5個因素為自變量,發(fā)酵液抑菌圈直徑(Y)為響應值,確定各因素的高(1)低(-1)水平值,進行PB試驗設計。PB試驗設計因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

1.3.6 中心組合試驗設計

根據PB試驗結果,確定發(fā)酵時間、接種量、搖瓶轉速為主要考察因素,以單因素試驗結果的最適條件作為中心水平,即0水平［14-15］,并以之為中心,利用響應面分析法的中心組合設計(central composite design,CCD)試驗對鏈霉菌Z331-A發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

1.3.7 數據處理

采用最小顯著差法(leastsignificantdifference,LSD)對結果進行顯著差異分析。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

由圖1可知,在高氏一號、黃豆粉、PDB、YEPD、LB、ISP-2這6種液體培養(yǎng)基中,菌株Z331-A在ISP-2培養(yǎng)基中發(fā)酵時對供試細菌(枯草芽孢桿菌)產生的抑菌圈直徑最大,為17.11 mm,其次為高氏一號培養(yǎng)基(15.29 mm),YEPD培養(yǎng)基(13.13 mm),LB培養(yǎng)基(12.34 mm),黃豆粉培養(yǎng)基(11.2 mm),PDB培養(yǎng)基(9.5 mm),所以選用ISP-2培養(yǎng)基作為后續(xù)試驗的發(fā)酵培養(yǎng)基。

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選Fig.1 Screening of fermentation medium

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 發(fā)酵時間對發(fā)酵液抑菌活性的影響

考察發(fā)酵時間對抑菌圈直徑的影響,結果見圖2。由圖2可知,隨著發(fā)酵時間的延長,抑菌圈直徑呈先增加后減小的趨勢。發(fā)酵液的抑菌活性從第3天開始產生,當發(fā)酵時間為3～7 d時,發(fā)酵液對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑迅速增加；當發(fā)酵時間為7 d時,發(fā)酵液抑菌圈直徑達到最大值,為20.85 mm。繼續(xù)延長發(fā)酵時間,抑菌圈直徑開始減小。這可能與底物消耗和有害物質的積累產生的負面影響有關［16］。因此,選擇最佳發(fā)酵時間為7 d。

圖2 發(fā)酵時間對抑菌圈直徑的影響Fig.2 Effect of fermentation time on inhibition zone diameter

2.2.2 裝液量對發(fā)酵液抑菌活性的影響

考察裝液量對抑菌圈直徑的影響,結果見圖3。由圖3可知,隨著裝液量的增加,抑菌圈直徑呈先增加后減小的趨勢。當裝液量為10 mL/100 mL～30 mL/100 mL時,抑菌圈直徑迅速增加；當裝液量為30 mL/100 mL時,發(fā)酵液抑菌圈直徑達到最大值,為20.4 mm。繼續(xù)增加裝液量,抑菌圈直徑開始下降。這可能是由于通氣量減少,菌株生長受到抑制,導致抑菌活性下降。因此,選擇最佳裝液量為30 mL/100 mL。

圖3 裝液量對抑菌圈直徑的影響Fig.3 Effects of liquid volume on inhibition zone diameter

2.2.3 接種量對發(fā)酵液抑菌活性的影響

考察接種量對抑菌圈直徑的影響,結果見圖4。由圖4可知,隨著接種量的增加,抑菌圈直徑呈先增加后減小的趨勢。當接種量為2%～6%時,發(fā)酵液對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑迅速增加；當接種量為6%時,發(fā)酵液抑菌圈直徑達到最大值,為20.01 mm。繼續(xù)增加接種量,抑菌圈直徑開始緩慢下降。原因可能是種子液濃度過低,會導致生長緩慢,而種子液濃度過高,會引起菌體過早進入衰亡期,從而發(fā)酵能力下降［17］。因此,選擇最佳接種量為6%。

圖4 接種量對抑菌圈直徑的影響Fig.4 Effect of inoculum on inhibition zone diameter

2.2.4 搖瓶轉速對發(fā)酵液抑菌活性的影響

圖5 搖瓶轉速對抑菌圈直徑的影響Fig.5 Effect of shaker speed on inhibition zone diameter

考察搖瓶轉速對抑菌圈直徑的影響,結果見圖5。由圖5可知,隨著搖瓶轉速的增加,抑菌圈直徑呈先增加后減小的趨勢。當搖瓶轉速為160～200 r/min時,發(fā)酵液對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑迅速增加；當搖瓶轉速為200r/min時,發(fā)酵液抑菌圈直徑達到最大值,為20.45 mm。繼續(xù)增加搖瓶轉速,抑菌圈直徑開始下降。因此,選擇最佳搖瓶轉速為200 r/min。

2.2.5 培養(yǎng)溫度對發(fā)酵液抑菌活性的影響

考察培養(yǎng)溫度對抑菌圈直徑的影響,結果見圖6。由圖6可知,隨著培養(yǎng)溫度的升高,抑菌圈直徑呈先增加后減小的趨勢。當培養(yǎng)溫度為20～28℃時,發(fā)酵液對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑迅速增加；當培養(yǎng)溫度為28℃時,發(fā)酵液抑菌圈直徑達到最大值,為20.45 mm。繼續(xù)升高培養(yǎng)溫度,抑菌圈直徑開始下降。因此,選擇最佳培養(yǎng)溫度為28℃。

圖6 培養(yǎng)溫度對抑菌圈直徑的影響Fig.6 Effect of culture temperature on inhibition zone diameter

2.3 Plackett-Burman設計確定關鍵影響因素

在單因素試驗的基礎上,采用Design-Expert V 8.0.6軟件設計PB試驗各因素與水平,PB試驗設計及結果如表2所示,每組設置3個平行重復。

表2 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

采用SAS9.0軟件對表2的數據進行逐步回歸分析,得到偏回歸系數及顯著性檢驗結果見表3。由表3可知,因素X1、X3、X4的P值分別為＜0.000 1、0.000 7、0.070 9,即因素X1、X3對響應值Y的影響極顯著(P＞0.01),X4的P值＞0.05,但SAS 9.0軟件顯示各因素P值＜0.150 0水平均是有意義的,故將因素X4考慮進去,作為響應值Y影響的第3個因素。因此選擇影響抑菌圈直徑的關鍵因素為發(fā)酵時間、培養(yǎng)轉速和接種量。

表3 Plackett-Burman試驗的偏回歸系數及顯著性檢驗Table 3 Partial regression coefficients and significance test of Plackett-Burman experiments

2.4 響應面設計與分析

在PB試驗結果基礎上,用Design-Expert V8.0.6軟件,以抑菌圈直徑(Y)為響應值,對發(fā)酵時間(A)、接種量(B)和搖瓶轉速(C)這3個因素進行3因素3水平的中心組合試驗設計,響應面試驗設計與結果見表4,方差分析見表5。

表4 鏈霉菌Z331-A發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗設計與結果Table 4 Design and results of response surface experiments for fermentation conditions optimization of Streptomyces Z331-A

表5 響應面試驗結果方差分析Table 5 Variance analysis of response surface experiments results

運用Design-Expert V 8.0.6軟件對表4進行多元線性回歸和二項式擬合,得到發(fā)酵液抑菌活性大小響應面模擬方程如下：

Y=24.08+0.7A+0.2B+0.26C-0.17AB-0.42AC-0.017BC-0.92A2-0.12B2-0.16C2

由表5可知,回歸模型P=0.003 2＜0.01,說明模型達到差異極顯著水平,實驗設計可靠；模型相關系數R2為0.8580,表明其回歸方程擬合良好。模型一次項A、二次項A2差異均極顯著(P＜0.01),其他因素不顯著,由表5P值可知,3個因素對抑菌圈直徑影響大小依次為發(fā)酵時間＞搖瓶轉速＞接種量。失擬項P值為0.367 3＞0.05,即方程模型失擬項差異不顯著,表明該模型可信度高,能較好地反應各因素與響應值之間的關系。因此,利用該回歸方程能夠對實驗結果進行擬合和預測分析。

由圖7可以直觀地觀察出,發(fā)酵時間(A)、接種量(B)、搖瓶轉速(C)這3個因素對抑菌圈直徑(Y)的影響,影響越大坡度越陡。隨著A的增加,Y呈現先增加再減少的趨勢,表明發(fā)酵時間有最優(yōu)值；在3個響應面圖中其坡度最陡,表明發(fā)酵時間對抑菌圈直徑的影響最顯著,與表4方差分析結果相吻合。這3個因素之間交互作用的強弱可以通等高線形狀直觀地反映出來,交互作用越明顯,則等高線的橢圓形越明顯,反之就越圓。依據圖7,這3個因素的交互作用為AC＞AB＞BC,與表5方差分析結果相符。

圖7 發(fā)酵時間、接種量、搖瓶轉速交互作用對抑菌圈直徑影響的響應面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour line of the effects of interaction between fermentation time,inoculum and shaker speed on inhibition zone diameter

2.5 最優(yōu)發(fā)酵條件預測及試驗結果驗證

運用Design-Expert軟件對模型進行最優(yōu)化預測,最大抑菌圈直徑為24.29 mm,得到鏈霉菌Z331-A最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時間7.21 d,接種量5.65%,搖瓶轉速210.18 r/min,在此發(fā)酵條件下,抑菌圈直徑預測值為24.29 mm。

為了進一步驗證模型預測的最佳發(fā)酵工藝條件的準確性,同時考慮到實際操作,將發(fā)酵條件修正為發(fā)酵時間7.2 d,接種量5.7%,搖瓶轉速210 r/min。在此最佳發(fā)酵條件下,進行3次驗證試驗,得到抑菌圈直徑為24.30 mm,與模型預測值相接近,而且相比優(yōu)化前的抑菌圈直徑19.20 mm提高了26.56%。表明響應面法優(yōu)化鏈霉菌Z331-A發(fā)酵條件真實可靠,可以較大提高發(fā)酵液的抑菌活性。

3 結論

本研究從6種培養(yǎng)基中篩選獲得ISP-2培養(yǎng)基所發(fā)酵的鏈霉菌Z331-A發(fā)酵液對枯草芽孢桿菌抑菌效果最佳。以抑菌圈直徑為考察指標,在單因素試驗的基礎上,對鏈霉菌Z331-A的發(fā)酵條件進行響應面試驗優(yōu)化。結果表明,鏈霉菌Z331-A的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時間7.2 d,接種量5.7%,培養(yǎng)轉速210 r/min。在此最佳發(fā)酵條件下,抑菌圈直徑為24.30 mm,與模型預測值(24.29 mm)接近,與未優(yōu)化前(19.20 mm)相比,抑菌圈直徑提高了26.56%。為后續(xù)對該菌的開發(fā)和研究提拱了很好基礎。

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(1)新工藝、新技術、新設備在釀造行業(yè)的應用；(2)調味品的研發(fā)創(chuàng)新與推廣應用；(3)調味品產業(yè)生產管理及產品質量安全評價；(4)食品添加劑在釀造行業(yè)的應用；(5)現代高新檢測技術在釀造行業(yè)的應用；(6)釀酒產品開發(fā)、生產管理及產品質量安全的控制；(7)發(fā)酵法制備酒精、氨基酸、高級醇及有機酸等工藝研究；(8)微生物發(fā)酵工藝及培養(yǎng)基發(fā)酵條件優(yōu)化；(9)發(fā)酵工程菌種的篩育與人工誘變、雜交選育及基因工程改造研究；(10)生物質能源的開發(fā)利用及規(guī)?；苽?；(11)傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產工藝改進、微生物菌種改良、發(fā)酵機理及規(guī)模化生產研究；(12)食品及發(fā)酵工業(yè)廢水、廢渣處理及綜合利用；(13)益生菌及功能型發(fā)酵乳制品研究與開發(fā)；(14)行業(yè)實用技術、政策、法規(guī)、標準及行業(yè)動態(tài)和最新舉措等。

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(1)來稿要求論點明確、數據可靠、邏輯嚴密、文字精煉。在文稿首頁用腳注說明論文屬何項目、何基金(編號)資助,本刊將優(yōu)先報道國家級、省部級及國際合作項目的科研成果；第一作者及通訊作者(一般為導師)簡介(包括姓名、出生年月、性別、職稱、學位、研究方向或目前主要從事的工作、郵箱、聯(lián)系電話)。(2)稿件要求8000字以內,須有中圖分類號,文獻標志碼,中英文標題、單位、作者,并有200～300字的中英文摘要和5～8個關鍵詞,標題、摘要、表題、圖題請用中英文對照。摘要內容應包括研究目的、方法、結果和結論；綜述文章可寫指示性摘要。(3)來稿內容涉及配方時,應寫明配料的名稱和配比,勿用代號；工藝過程要完整,不要省略；插圖、表格需放在正文相應地方,不要集中；引用的圖表要有出處,計量要用法定單位。(4)文稿參考文獻一般研究論文約25篇參考文獻,不可少于20篇,綜述論文不少于35篇。研究性論文和綜述性論文中近5年文獻不少于參考文獻總數的一半,外文文獻不少于5篇,期格式請參照GB/T 7714—2015《信息與文獻參考文獻著錄規(guī)則》。(5)來稿必須是最新的、作者自身創(chuàng)造性的科研成果,且是在中外文正式刊物上未發(fā)表的論文。本刊嚴禁一稿多投、重復內容多次投稿、不同文種重復投稿。(6)我刊以實現對所有來稿的文字復制比對工作,若文字復制比超過30%的稿件我刊不予采用。(7)稿件一經錄用,即被認為同意收錄于《中國學術期刊(光盤版)》、萬方數據庫等,同意入編數據庫及上網發(fā)布,與此有關的作者著作權使用費與稿酬一次性給付。作者如有異議,請在投稿時聲明。