酸奶中常見真菌的分離、鑒定與快速檢測

杜 瑩,潘佩平,李 敏,李 瑤,范曉軍*

(1.山西省生物研究所,山西 太原 030006；2.太原理工大學 化學化工學院,山西 太原 030024)

乳制品是一種營養(yǎng)豐富,容易被人體消化吸收的天然食品,隨著人們生活水平的提高,相關(guān)產(chǎn)品已經(jīng)成為生活中常見的健康食品。但是營養(yǎng)豐富的乳制品也是各種微生物青睞的溫床,這導(dǎo)致乳制品的保質(zhì)期非常有限,比如經(jīng)巴氏殺菌的乳制品保質(zhì)期一般不超過7 d(巴氏鮮奶占全球液態(tài)奶70%的市場份額)［1］,近些年市場占有量越來越大的發(fā)酵酸奶,其保質(zhì)期最多也只有21 d［2］。

另一方面,國家《食品安全法》和《企業(yè)生產(chǎn)乳制品許可條件審查細則(2010版)》中明確要求企業(yè)必須對所生產(chǎn)、加工的乳制品進行出廠前微生物檢驗,包括5種指示菌和5種致病菌的檢測［3］。目前乳制品企業(yè)基本都是采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法來檢測微生物,這種方法的檢測周期一般在3～5 d左右,甚至有些致病菌不能僅憑菌落形態(tài)來判定,需要配合其他生化反應(yīng)試驗做進一步鑒定,這無疑又增加了檢測周期。作為一種快速、準確的檢測方法,熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(realtime-fluorescence quantitative-polymerase chain reaction,RT-FQ-PCR)技術(shù)已經(jīng)被權(quán)威部門認可并納入部分食品微生物檢測國標中［4］,尤其是近些年越來越多的國家標準中采納了這一方法。如進出口行業(yè)對難于培養(yǎng)的霍亂弧菌、副溶血性弧菌等微生物的檢測都是采用熒光定量PCR技術(shù)［5-6］。

熒光定量PCR因其準確、快速等特點,已用于乳品中微生物快速檢測。張巧艷等［7］將這一技術(shù)應(yīng)用于乳制品中沙門氏菌的檢測,將沙門氏菌的檢測時間縮短至3 h,但該方法在3 h的檢測下限為100 CFU/mL,在微生物含量較低的情況下該方法仍然存在一定的假陰性。在酵母的快速檢測上,夏乾峰等［8］建立了一種可以檢測5種酵母菌的熒光定量PCR方法,其優(yōu)化后的熒光定量PCR檢測方法的靈敏度為5CFU/mL,然而該方法的檢測對象為純化后的酵母菌,未深入研究樣本類型對檢測靈敏度的影響。顯然,酸奶作為一種高蛋白含量的樣本類型,在DNA提取過程中存在高濃度蛋白背景污染的問題,此外,真菌具有較為致密復(fù)雜的細胞壁結(jié)構(gòu),這些因素都會影響對酵母、霉菌DNA檢測的準確性。目前,使用熒光定量PCR技術(shù)檢測乳制品中真菌的研究還鮮有報道。本研究首先對導(dǎo)致酸奶腐敗變質(zhì)的微生物進行分離、鑒定,通過改良的DNA提取方法,獲取酸乳中微生物總DNA,建立了污染微生物的熒光定量PCR標準檢測曲線,形成了一套乳制品常見微生物的快速檢測體系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成品酸奶：市售某品牌酸奶；SYBR Green-qPCR擴增試劑：北京天根生化科技有限公司。

孟加拉紅固體培養(yǎng)基：稱取蛋白胨5.0 g,葡萄糖10.0 g,磷酸二氫鉀1.0 g,無水硫酸鎂0.5 g,瓊脂20.0 g,孟加拉紅0.033g,加入蒸餾水中,加熱融化,補足蒸餾水至1 000 mL,分裝后121℃滅菌20 min。傾注平板前,用少量乙醇溶解0.1 g氯霉素加入培養(yǎng)基中。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-30S2型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司；Mastercycler pro SPCR儀：艾本德中國有限公司；WD-9413C型凝膠成像分析儀：北京市六一儀器廠；DH-360電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；CFX96Touch熒光定量PCR儀：美國伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離

取10 mL經(jīng)過巴氏滅菌的新鮮制備的酸奶,開蓋置于空氣中,室溫放置7 d。待空氣中的微生物已經(jīng)自然沉降至酸奶上并形成肉眼可見的菌落后,挑取酸奶上出現(xiàn)的不同形態(tài)的菌落至5 mL滅菌蒸餾水中,振蕩混勻后取1 mL涂布至孟加拉紅固體培養(yǎng)基上。28℃條件下恒溫培養(yǎng)5 d。固體培養(yǎng)基上長出菌落后挑取至孟加拉紅液態(tài)培養(yǎng)基中擴培。

1.3.2 菌種鑒定

取1 mL經(jīng)過步驟1.3.1制備的菌液,離心后將沉淀物置于-80℃中冷凍30 min,隨后采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium ammonium bromide,CTAB)法抽提沉淀菌體的DNA。用真菌ITS擴增通用引物ITS5(5‘-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3‘)和ITS4(5‘-TCCQCCGCQTATTGATATGC-3‘)對提取的DNA進行擴增［9］,擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后進行Sanger上機測序。將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast同源比對檢索,查找與被測菌種在ITS序列相似性最高的物種。

1.3.3 DNA條形碼確定

在進行物種DNA鑒定時,首先選擇最佳的DNA擴增片段,不同的DNA序列存在不同的擴增效率和區(qū)分層次［10］。針對1.3.1分離鑒定出來的微生物,為了選擇一個合適的基因片段作為熒光定量PCR檢測靶點,本研究選取了4個較為常用的基因片段進行擴增效率比較,分別為β-tubulin［11］、RPB1［12］、LSU［13］、ITS,針對四個片段設(shè)計的PCR引物及序列見表1。

表1 PCR引物序列設(shè)計Table 1 Sequences design of PCR primers

1.3.4 熒光定量PCR檢測體系

將擴培的真菌原液進行梯度稀釋,分別稀釋10、102、103、104倍,取104倍稀釋的菌液100 μL涂布于孟加拉紅固體培養(yǎng)基上,28℃條件下培養(yǎng)至形成了明顯菌落并且菌落未連在一起的時候,對菌落進行計數(shù)。

將上述梯度稀釋后的菌液各取100μL,加入到500μL滅菌酸奶樣品中,充分混勻后12 000 r/min離心5 min,去上清液,將沉淀物放入-80℃冰箱中冷凍30 min后進行液氮研磨,用1.3.2中描述的方法抽提各稀釋濃度梯度下的微生物DNA。用1.3.3實驗步驟確定的最佳擴增基因片段,對各濃度梯度下提取的DNA進行SYBRGreen-qPCR擴增,記錄每個反應(yīng)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)Cq值及對應(yīng)的熒光檢測值。建立檢測菌數(shù)與Cq值的關(guān)聯(lián)曲線。結(jié)合DNA提取的洗脫液體積70μL及PCR時可用最大模板量18μL,指出檢測菌數(shù)X的計算公式為N×18/70×r,其中N為平板計數(shù)結(jié)果,r為稀釋倍數(shù)［14-15］。

SYBRGreen-qPCR的反應(yīng)體系(20μL)：EvaGreen 2×qPCRMasterMix10μL,正向引物10μmol/L 1μL,反向引物10μmol/L 1μL,基因組模板18μL。SYBRGreen-qPCR反應(yīng)條件為：95℃、3 min,進入36個循環(huán)(95℃、15 s,56℃、30s,72℃、30 s),在72℃延伸階段進行熒光采集,最后72℃恒溫5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物分離與鑒定結(jié)果

酸奶置于空氣中靜置7 d后,發(fā)現(xiàn)9個肉眼可見的菌落,將其轉(zhuǎn)移至孟加拉紅培養(yǎng)基純化、擴培,經(jīng)ITS序列鑒定這9個菌落分別屬于紅酵母(Rhodotorula sp.)、青霉菌(Penicillium sp.)、根霉菌(Rhizopus sp.)這三種菌種(菌落形態(tài)參見圖1),其中紅酵母出現(xiàn)的概率最大,具體真菌鑒定結(jié)果參見表2。

圖1 三種純化真菌平板菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of three purified fungiplates

表2 酸奶污染真菌基于ITS序列鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of fungiin yogurt based on ITS sequence

由此可見,酸奶常見的真菌污染類型以酵母和霉菌為主,其中酵母出現(xiàn)概率更大,在酸奶的實際的加工生產(chǎn)環(huán)境中,要重點預(yù)防空氣中紅酵母(Rhodotorula sp.)和根霉菌(Rhizopus sp.)的污染。

2.2 檢測DNA條形碼的確定

圖2 酵母菌N1及根霉菌X1 4種PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of four PCR products from yeast N1 and Rhizopus sp.X1

分別提取表2中的編號為N1酵母菌和編號為X1根霉菌基因組,作為PCR擴增模板,用表1中設(shè)計的PCR引物分別進行PCR擴增及電泳檢測,以選取最佳的DNA檢測片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,檢測結(jié)果如圖2。由圖2結(jié)果可知,ITS和LSU這兩個基因片段在酵母和霉菌均呈現(xiàn)較好的擴增效果,而另兩種基因片段擴增失敗,因此將ITS和LSU作為快速檢測酸奶中真菌的DNA條形碼。

2.3 熒光定量PCR快速檢測體系

在完成各菌液濃度梯度的技術(shù)和計算后,將其回接至酸奶中,按照上述方法提取真菌基因組DNA,利用ITS片段作為檢測靶點,進行熒光定量PCR檢測并收集相關(guān)數(shù)據(jù),各濃度梯度的真菌均得到了完整的擴增曲線,具體檢測菌數(shù)與Cq值參見表3。

表3 不同濃度的真菌檢測數(shù)量與Cq值Table 3 Determination results of different fungiconcentration and Cq value

將表3兩種真菌的被檢數(shù)量對數(shù)值lgX(x)與檢測采集的Cq值(y)進行關(guān)聯(lián)分析,并得出兩者之間的擬合關(guān)聯(lián)方程式,具體關(guān)聯(lián)結(jié)果分別參見圖3。

圖3 紅酵母(A)與根霉菌(B)檢測數(shù)量與Cq值關(guān)聯(lián)曲線Fig.3 Correlation curve between count and Cq value of Rhodotorula sp.(A)and Rhizopus sp.(B)

通過圖3的趨勢線可知,隨著真菌數(shù)量的增加,檢測系統(tǒng)的熒光值也在隨之升高,這說明熒光強度與真菌數(shù)量存在很強的關(guān)聯(lián)性,通過繪制與熒光值相對等的Cq值和真菌數(shù)量的對數(shù)值之間的關(guān)聯(lián)曲線,在紅酵母50 CFU/mL到50×104CFU/mL的5個數(shù)量級之間獲得相關(guān)系數(shù)為0.9362的良好線性關(guān)系曲線(圖3a),回歸方程為Y=0.536X+34.462(Y代表系統(tǒng)檢測到的Cq值,X代表紅酵母數(shù)量的對數(shù)值)。在根霉菌2 850 CFU/mL到2 850×104CFU/mL的5個數(shù)量級之間獲得相關(guān)系數(shù)為0.9581的良好線性關(guān)系曲線(圖3b),回歸方程為Y=1.374X+29.722(Y代表系統(tǒng)檢測到的Cq值,X代表根霉菌數(shù)量的對數(shù)值)。10次重復(fù)檢測500CFU/mL紅酵母獲得的相對標準偏差為3.7%,10次重復(fù)檢測28 500 CFU/mL根霉菌獲得的相對標準偏差為3.2%,說明此體系對該類型真菌的檢測重復(fù)性較好。綜上所述,本研究所構(gòu)建的熒光定量檢測體系,可在5 h完成酸奶樣品中真菌核酸的熒光定量檢測,獲得檢測Cq值后根據(jù)各自的關(guān)聯(lián)方程可推算出樣品中的真菌數(shù)量。

3 結(jié)論

本研究首先明確了空氣中能造成酸奶污染的真菌種類,紅酵母(Rhodotorula sp.)、青霉菌(Penicillium sp.)、根霉菌(Rhizopus sp.)是三種能在酸奶中生長的真菌種類,其中紅酵母最為常見,在實際的酸奶加工生產(chǎn)中應(yīng)該重點預(yù)防。本研究的真菌分離鑒定結(jié)果對乳制品加工企業(yè)在真菌污染防治上提供了針對性參考。

在酸奶污染真菌的DNA快速檢測技術(shù)流程上,本研究首先解決了真菌破壁困難、乳品高蛋白背景的基因組抽提問題,并進一步比較了不同基因片段的PCR擴增效率,明確了適合酸奶污染真菌的最佳檢測DNA條形碼和條件,在此基礎(chǔ)上建立了初始檢測真菌數(shù)量與熒光信號值之間的關(guān)聯(lián),形成了一套酸奶真菌DNA快速檢測體系。相比傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測方法,本研究所形成的快速檢測體系,檢測流程縮短了檢測時間至5 h內(nèi),加快了酸奶的出廠時間,從而也延長了酸奶的貨架期。

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