一株凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

董佩佩,汪祥燕,劉元香,辛國芹*,徐海燕,谷 巍,鄭軍紅,陳梅楠

(1.山東寶來利來生物工程股份有限公司,山東 泰安 271000；2.山東省泰安市植物保護(hù)站,山東 泰安 271000)

凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)是一類可以形成芽孢同時(shí)又產(chǎn)乳酸的細(xì)菌［1］,其除了具有一般乳酸菌的產(chǎn)酸、可調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道健康、提高消化能力和提高免疫力的益生性能外［2］,還具有芽孢菌耐高溫、耐膽鹽、耐酸等抗逆性［3-5］,被美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration,FDA)和美國飼料控制官員協(xié)會(huì)列入可用于飼料的安全微生物菌種名單［6］,廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥［7］、畜禽［8-10］和水產(chǎn)［11-12］等行業(yè)。芽孢無新陳代謝,能耐熱、紫外線、多種溶劑、酸、堿等,所以該芽孢桿菌制成的菌劑是較為理想的微生物制劑［13］。由于最終制成的菌劑要有芽孢的形式才具有高抗性,所以如何獲得高活性高濃度的芽孢是制約凝結(jié)芽孢桿菌制劑生產(chǎn)的關(guān)鍵因素［14］,且發(fā)酵凝結(jié)芽孢桿菌的培養(yǎng)基配方又是進(jìn)行后續(xù)生產(chǎn)的重要條件。

目前,對(duì)于凝結(jié)芽孢桿菌的研究重點(diǎn)在于如何用低廉易獲得的培養(yǎng)基獲得高濃度的凝結(jié)芽孢桿菌芽孢。路程等［15］對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌T50進(jìn)行產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化,確定培養(yǎng)基組成為蛋白胨2%,葡萄糖0.2%,酵母浸粉0.3%,麩皮5%；培養(yǎng)基初始pH 7.0,接種量2%,培養(yǎng)時(shí)間3 d,最終使芽孢形成率達(dá)到94.3%,但對(duì)發(fā)酵終點(diǎn)活菌數(shù)沒有體現(xiàn)。吳逸飛等［16］對(duì)一株凝結(jié)芽孢桿菌的培養(yǎng)基原料及接種量、通氣量等培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,最終獲得芽孢數(shù)為3.5×108CFU/mL。孫麗娜等［17］通過發(fā)酵罐分批補(bǔ)料的方式得到凝結(jié)芽孢桿菌13002發(fā)酵終點(diǎn)活菌總數(shù)為3.095×109CFU/mL,最終凍干后達(dá)0.730×1011CFU/g。培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng),不易產(chǎn)孢,培養(yǎng)基及后處理工藝成本較高是制約凝結(jié)芽孢桿菌規(guī)?；a(chǎn)的主要原因。

因此,該研究通過單因素試驗(yàn)對(duì)菌株碳氮源及無機(jī)鹽進(jìn)行篩選,Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)對(duì)影響因子進(jìn)行考察和評(píng)價(jià),然后對(duì)關(guān)鍵影響因素進(jìn)行最陡爬路徑試驗(yàn),進(jìn)一步采用響應(yīng)面法研究和探討其交互作用,獲得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成,為其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)(菌種保藏號(hào)BLCC1-0517)：山東寶來利來生物工程股份有限公司菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基［18］：葡萄糖2 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母膏5 g/L,氯化鈉5 g/L,瓊脂15 g/L,pH 7.0,121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基［18］：葡萄糖2 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母膏5 g/L,氯化鈉5 g/L,pH 7.0,121℃滅菌20 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基［19］：可溶性淀粉10 g/L,豆粕5 g/L,硫酸錳0.34 g/L,pH 7.0,121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)：江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司；GZX-9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；THZ-C恒溫振蕩器：揚(yáng)州培英實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；OLYMPUSCX31型顯微鏡：日本奧林巴斯株式會(huì)社；DPH-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵方法及培養(yǎng)條件

菌種活化：將實(shí)驗(yàn)室保藏的凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)用斜面培養(yǎng)基活化,恒溫培養(yǎng)箱中42℃培養(yǎng)48h。

種子培養(yǎng)：將活化好的凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)接種到種子液體培養(yǎng)基中,于42℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h,獲得液體種子。

發(fā)酵培養(yǎng)：向基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中接入2%的種子液,于42℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h。

1.3.2 菌體數(shù)及芽孢數(shù)檢測(cè)

菌體數(shù)測(cè)定：發(fā)酵液取樣,用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋,傾注法檢測(cè)含菌量,重復(fù)3次。

芽孢數(shù)測(cè)定：取5 mL發(fā)酵液,80℃水浴熱處理10 min,用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋,傾注法檢測(cè)芽孢的形成量,重復(fù)3次。

1.3.3 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

碳源的確定：將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源分別用玉米淀粉、玉米面、麩皮、麥芽糊精、葡萄糖、蔗糖、低聚異麥芽糖、可溶性淀粉替換,添加量為1.0%,其他成分不變。接種量為2%,裝液量為10%,置于42℃、180r/min條件下培養(yǎng)48 h,檢測(cè)發(fā)酵液中的芽孢數(shù),考察不同的碳源對(duì)菌株芽孢的形成量的影響。

氮源的確定：將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源分別用豆粕、蛋白胨、尿素、酵母膏、牛肉膏替換,添加量為0.5%,其他成分不變。接種量為2%,裝液量為10%,置于42℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h,檢測(cè)發(fā)酵液中的芽孢數(shù),考察不同的氮源對(duì)菌株芽孢的形成量的影響。

無機(jī)鹽的確定：去掉基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽,分別添加0.002 mol/L硫酸錳、硫酸鎂、氯化鈉、三氯化鐵、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、碳酸鈣和硝酸鈉,以不加任何無機(jī)鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基作對(duì)照,其他成分不變。接種量為2%,裝液量為10%,置于42℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h,檢測(cè)發(fā)酵液中的芽孢數(shù),考察不同的無機(jī)鹽對(duì)菌株芽孢的形成量的影響。

1.3.4 培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

(1)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)碳氮源單因素篩選試驗(yàn)及無機(jī)鹽單因素試驗(yàn)結(jié)果,采用N=12的Plackett-Burman(PB)設(shè)計(jì),把每個(gè)因素設(shè)計(jì)成高(+1)和低(-1)2個(gè)水平,對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵液中的芽孢數(shù)進(jìn)行響應(yīng)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,確定麩皮(A)、牛肉膏(B)、硫酸鎂(C)、硫酸錳(D)、磷酸二氫鈉(E)這5個(gè)因素為PB試驗(yàn)的考察對(duì)象。根據(jù)PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案配制培養(yǎng)基,接種量為2%,裝液量為10%,置于42℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h。PB試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

(2)最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果各顯著影響因素效應(yīng)的大小設(shè)定步長(zhǎng)及變化方向,以快速逼近最佳區(qū)域。而其他因素的取值則根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)和大小確定,正效應(yīng)的因素均取較高值,負(fù)效應(yīng)的因素均取較低值。

(3)響應(yīng)面分析試驗(yàn)方法

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果,顯著因素以中心點(diǎn)為零水平,高水平和低水平分別比零水平高于或低于一個(gè)實(shí)際步長(zhǎng)。采用Design Expert version 8.0.5軟件中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)(central compositedesign,CCD)進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響

圖1 不同碳源對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on the spore number of B.coagulans

不同碳源對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響見圖1。由圖1可知,麩皮作為唯一碳源時(shí),發(fā)酵液中的芽孢數(shù)最多,達(dá)到1.03×108CFU/mL,其次是低聚異麥芽糖,芽孢數(shù)為8.53×107CFU/mL。葡萄糖作為單一碳源時(shí),芽孢最少,芽孢數(shù)為5.01×106CFU/mL。綜合成本及芽孢數(shù)情況,選擇麩皮為后續(xù)研究的碳源。

2.2 不同氮源對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響

不同氮源對(duì)芽孢數(shù)的影響見圖2。由圖2可知,牛肉膏作為氮源時(shí)發(fā)酵液中芽孢數(shù)最高,為1.01×108CFU/mL,其次是豆粕,發(fā)酵液芽孢數(shù)為8.86×107CFU/mL。蛋白胨和尿素作為氮源時(shí),芽孢數(shù)較少,分別為2.23×107CFU/mL和1.17×107CFU/mL。所以選擇牛肉膏作為后續(xù)試驗(yàn)的氮源。

圖2 不同氮源對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on the spore number of B.coagulans

2.3 不同無機(jī)鹽對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響

不同無機(jī)鹽對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知,添加硫酸錳、硫酸鎂和磷酸二氫鈉時(shí),發(fā)酵液芽孢數(shù)分別為9.70×107CFU/mL、1.19×108CFU/mL、8.93×107CFU/mL,均高于對(duì)照組芽孢數(shù)5.80×107CFU/mL。所以選擇硫酸錳、硫酸鎂和磷酸二氫鈉作為無機(jī)鹽。

圖3 不同無機(jī)鹽對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響Fig.3 Effects of different inorganic salts on the spore number of B.coagulans

2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

按PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn),把每個(gè)因素設(shè)計(jì)成高(+1)和低(-1)2個(gè)水平,高水平是低水平的1.5倍。PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值結(jié)果見表2,各因素水平及顯著性分析見表3。

表2 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

由表3分析結(jié)果可知,麩皮和牛肉膏為正效應(yīng),硫酸鎂、硫酸錳、磷酸二氫鈉為負(fù)效應(yīng)。從P值來看,可信度＞95%的因素為麩皮和牛肉膏,影響顯著(P＜0.05)；其他因素在α=0.05水平上對(duì)芽孢數(shù)影響不顯著(P＞0.05)。確定麩皮和牛肉膏作為主要影響因素進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)因素效應(yīng)分析Table 3 Effect analysis of factors of Plackett-Burman experiments

2.5 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)表3分析結(jié)果,顯著因素的變化步長(zhǎng)及方向的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of the steepest ascent experiments

由表4可知,第3組試驗(yàn)麩皮30.0 g/L,牛肉膏15 g/L時(shí)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵液中芽孢數(shù)最高,為25.65×107CFU/mL。故采用麩皮30.0 g/L,牛肉膏15.0 g/L為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.6 響應(yīng)面分析的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)確定了重要影響因素的取值區(qū)間。利用Design Expert version 8.0.5進(jìn)行中心組合的試驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)基中的關(guān)鍵因素做進(jìn)一步的研究和探討。以麩皮和牛肉膏為自變量,以凝結(jié)芽孢桿菌芽孢數(shù)(Y)為響應(yīng)值,進(jìn)行2因素5水平的中心復(fù)合設(shè)計(jì)試驗(yàn),試驗(yàn)因素與水平見表5,設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6,回歸模型方差分析結(jié)果見表7。

表5 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 5 Factors and levels of central composite experiments design

表6 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of central composite experiments

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

根據(jù)表6試驗(yàn)結(jié)果通過Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析,建立多元二次回歸方程如下：Y=31.68+2.64A+0.47B+1.32AB-12.69A2-13.05B2

由表7可知,模型P=0.016 1＜0.05,表明模型對(duì)響應(yīng)值Y的影響顯著,可信度較高；模型的二次項(xiàng)對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌芽孢數(shù)的效應(yīng)影響極顯著(P＜0.01)；模型失擬項(xiàng)的P值為0.910 2,影響不顯著(P＞0.05),表明多元回歸方程具有顯著性,模型能對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)芽孢數(shù)進(jìn)行較好的分析和預(yù)測(cè)。

2.7 最適培養(yǎng)基組成的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)上述回歸方程繪出響應(yīng)面分析圖,以確認(rèn)麩皮和牛肉膏對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)芽孢數(shù)的影響,響應(yīng)面圖見圖4。

圖4 麩皮與牛肉膏交互作用對(duì)芽孢數(shù)影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between bran and beef extract on spore number

由圖4可知,該方程的拋物線圖形開口向下,說明方程存在最大值,即響應(yīng)面范圍覆蓋了最大值所在的區(qū)域。由Design Expert version 8.0.5軟件分析得到最適培養(yǎng)基中麩皮和牛肉膏對(duì)應(yīng)的實(shí)際值分別為32.12g/L和15.24g/L。由此可知,最適培養(yǎng)基組成為麩皮32.12 g/L,牛肉膏15.24 g/L,硫酸鎂0.49 g/L,硫酸錳0.34 g/L,磷酸二氫鈉0.31 g/L。預(yù)測(cè)在此組成條件下發(fā)酵凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)芽孢數(shù)最高,理論值為3.18×108CFU/mL。

使用最優(yōu)培養(yǎng)基進(jìn)行凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)驗(yàn)證試驗(yàn),實(shí)際芽孢數(shù)為3.38×108CFU/mL,略高于預(yù)測(cè)結(jié)果,說明響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

經(jīng)過單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析,確定凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為麩皮32.12 g/L,牛肉膏15.24 g/L,硫酸鎂0.49 g/L,硫酸錳0.34 g/L,磷酸二氫鈉0.31 g/L。在此配方條件下發(fā)酵凝結(jié)芽孢桿菌,芽孢數(shù)達(dá)到3.38×108CFU/mL,是優(yōu)化前的5.28倍。

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