凡納濱對(duì)蝦P53親水肽段原核表達(dá)及抗體制備

劉 歡， 黃明珠， 陳曉燕， 房春娟， 姜雯雯， 朱芳芳， 熊志偉

(江西科技學(xué)院護(hù)理學(xué)院，江西南昌 330098)

凡納濱對(duì)蝦(別稱南美白對(duì)蝦)是當(dāng)今世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)量最高的三大蝦類之一。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，對(duì)蝦病害已經(jīng)成為制約該產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要障礙。凡納濱對(duì)蝦為較低等的水生節(jié)肢動(dòng)物，其生理特征表現(xiàn)為對(duì)病害的易感性。生長(zhǎng)、發(fā)育的生命周期較短，各器官和系統(tǒng)形成迅速、構(gòu)造簡(jiǎn)單，較高的新陳代謝水平和較低等的器官結(jié)構(gòu)使得凡納濱對(duì)蝦對(duì)病原體抵抗能力較弱。凡納濱對(duì)蝦的鰓直接與水體接觸，在進(jìn)行呼吸和排泄時(shí)，各種外界惡劣的環(huán)境條件直接接觸鰓結(jié)構(gòu)，因此病原體較易感染或通過(guò)鰓部而影響全身。凡納濱對(duì)蝦的生命周期中有蛻殼的生理特點(diǎn)，蛻殼前凡納濱對(duì)蝦停止進(jìn)食，蛻殼之后蝦體又非常脆弱，在此期間蝦體的防御能力減弱，對(duì)病原體和敵害的抵抗力極差，因而極易被病原體感染[1]。隨著養(yǎng)殖水域受到嚴(yán)重污染，水質(zhì)的富營(yíng)養(yǎng)化，水體的酸堿化，重金屬污染等都是目前非常嚴(yán)重的問(wèn)題[2]，養(yǎng)殖強(qiáng)度的擴(kuò)大和養(yǎng)殖環(huán)境惡化將給對(duì)蝦病害的控制帶來(lái)更大的挑戰(zhàn)。

機(jī)體在對(duì)抗病害、重金屬、環(huán)境等因素脅迫時(shí)，會(huì)導(dǎo)致負(fù)氧離子等活性氧(ROS)的產(chǎn)生[3-4]，高濃度的氧化自由基會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至細(xì)胞死亡[5]。P53與DNA的完整性、細(xì)胞周期、呼吸暴發(fā)都有密切聯(lián)系[6-7]。亞硝酸鹽應(yīng)激誘導(dǎo)對(duì)蝦血細(xì)胞產(chǎn)生了過(guò)量的NO和ROS，造成氧化脅迫作用，誘導(dǎo)凋亡P53基因的表達(dá)[8]。在重金屬和低pH值環(huán)境的應(yīng)激下，凡納濱對(duì)蝦P53基因表達(dá)與LvMnSOD和LvGPx有著密切的聯(lián)系[9]。十足目的P53對(duì)損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)以保證正常的精子發(fā)生，或引發(fā)凋亡以去除不正常的精細(xì)胞[10]。本研究通過(guò)分析凡納濱對(duì)蝦P53序列親水性，利用原核表達(dá)獲得親水肽段，免疫大白兔獲得多克隆抗體，探索出1條簡(jiǎn)單高效地獲得P53多克隆抗體的途徑，為P53的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 大腸桿菌EscherichiacoliDH5α、E.coliBL21菌株，原核表達(dá)載體pet32a，PMD-18T載體，購(gòu)自TaKaRa公司。

1.1.2 試劑 弗氏完全佐劑/弗氏不完全佐劑，為Sigma公司產(chǎn)品；NC膜為Pall Life Science公司產(chǎn)品；Ni NTA填料，Trizol試劑，購(gòu)自Invitrogen公司；酵母浸出膏、胰蛋白胨、蛋白胨，為MD Bioscience公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒小提試劑盒，為Axygen產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit、T4DNA連接酶，為TaKaRa公司產(chǎn)品；預(yù)染低分子量蛋白Marker，為BIO-RAD公司產(chǎn)品；動(dòng)物蛋白提取試劑盒，為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，為北京鼎國(guó)生物科技有限公司產(chǎn)品。其余產(chǎn)品為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 從GenBank獲得凡納濱對(duì)蝦P53基因序列(ANN87874.1)，通過(guò)在線網(wǎng)站(http：//tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input)預(yù)測(cè)P53親水肽段，根據(jù)親水肽段編碼序列設(shè)計(jì)特異性引物，即上游引物P53s：5′-GCGAATTCATGCGTCACAAATTCGGCATCTCCCTC C-3′，下游引物P53x：5′-GCTCTAGATTAATGATGATGATG ATGATGGCAC TTGCAGCACTTAATGTCCAG-3′(包含酶切位點(diǎn)、終止密碼子、6×His標(biāo)簽)擴(kuò)增P53親水肽段。引物由深圳華大基因合成。

1.2.2 凡納濱對(duì)蝦肝胰腺RNA提取和cDNA的合成 取肝胰腺，液氮冷凍研磨，按說(shuō)明書Trizol法提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.3 擴(kuò)增目的基因 以“1.2.2”節(jié)步驟中合成的cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序?yàn)?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 4 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖膠電泳檢測(cè)，紫外燈下切膠后，用DNA凝膠回收試劑盒回收。

1.2.4 鑒定目的片段 將“1.2.3”節(jié)步驟回收的DNA片段與PMD-18T載體連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，轉(zhuǎn)化后涂氨芐青霉素(Amp)固體平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR，測(cè)序。測(cè)序正確的載體命名為PMD-18T-P53。

1.2.5 表達(dá)載體構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ對(duì)PMD-18T-P53和pet32a載體分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物跑1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切膠，通過(guò)DNA凝膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物按物質(zhì)的量比1 ∶5混合，按比例加入T4 DNA連接酶，4 ℃過(guò)夜，轉(zhuǎn)化DH5α，轉(zhuǎn)化后涂平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。測(cè)序正確的載體命名為pet32a-P53。

1.2.6 融合蛋白誘導(dǎo) 將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21，轉(zhuǎn)化后涂平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的菌株接種于含100 mmol/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中，180 r/min、37 ℃培養(yǎng)至D600 nm為0.4～0.6，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside，簡(jiǎn)稱IPTG)，使之終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)3 h后，每隔1 h取樣，跑十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱SDS-PAGE)蛋白膠檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

1.2.7 發(fā)酵產(chǎn)物純化 大量發(fā)酵后，收集菌體，用磷酸緩沖液重懸，在超聲波下破碎30 min；8 000 r/min，4 ℃，離心 15 min，棄上清；用含4 mol/L尿素的緩沖液溶解，12 000 r/min，4 ℃，離心20 min，留上清，0.4 μm濾膜過(guò)濾；依照Ni-NAT操作手冊(cè)進(jìn)行蛋白純化，跑SDS-PAG蛋白膠檢測(cè)蛋白純化情況。

1.2.8 抗體制備 重組蛋白溶液(含0.5～1.0 mg重組蛋白)加等體積弗氏完全佐劑，用注射器混勻，分多點(diǎn)注射于大白兔腹部及腹股溝，每隔7 d免疫1次，免疫4次后，收集血清。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段擴(kuò)增

由圖1、圖2可知，通過(guò)在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)P53親水肽段，以編碼親水肽段cDNA為模板擴(kuò)增目的片段，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證表明，在500 bp左右有亮帶，與預(yù)期大小相符，經(jīng)測(cè)序證實(shí)確為P53序列。

2.2 表達(dá)載體構(gòu)建

分別雙酶切載體和目的基因后，連接酶切后所需片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。由圖3可知，電泳后有2條條帶，較大的為開(kāi)環(huán)pet32a，較小 500 bp 左右的片段為目的片段，證實(shí)表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將構(gòu)建好的原核表達(dá)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE蛋白膠檢測(cè)，以加入IPTG之前菌體為對(duì)照，由圖4可知，誘導(dǎo)后的菌體在18 ku左右有明顯差異條帶，符合預(yù)期大?。挥蓤D5可知，通過(guò)鎳(Ni)柱純化后得到較單一條帶。

2.4 抗體制備檢測(cè)

純化蛋白免疫新西蘭白兔后，取血清，用抗體稀釋液與肝胰腺總蛋白進(jìn)行Western blot，結(jié)果見(jiàn)圖6。

3 討論

由于LvP53 ORF有超過(guò)1.5 kb的DNA序列，編碼蛋白分子量過(guò)大，不易表達(dá)，所以選擇其中一段含有多個(gè)親水位點(diǎn)的(即含多個(gè)抗原表位)序列。原核表達(dá)方法成熟且表達(dá)量大，通過(guò)原核表達(dá)獲得高拷貝數(shù)的免疫活性的P53抗原。在PCR獲得目的片段和連接酶切位點(diǎn)時(shí)，一般方法必須經(jīng)過(guò)2次PCR。在本研究中，直接連上酶切位點(diǎn)和HIS標(biāo)簽，引物設(shè)計(jì)超過(guò)20 bp，下游引物達(dá)到53 bp，1次PCR，一步到位，節(jié)約了時(shí)間和試劑。不足的是PCR產(chǎn)物中有大量的引物二聚體，通過(guò)切膠回收目的條帶，也能滿足做下一步研究的需求。

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