普通黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜種一代遺傳特征的微衛(wèi)星分析

李景芬， 采克俊， 公翠萍， 王 曙， 周志金

(1.湖州師范學(xué)院，浙江湖州 313000； 2.浙江省湖州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江湖州 313000)

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.2 試驗方法

取出無水乙醇固定的鰭條于另一1.5 mL離心管中，揮干乙醇，用小剪刀盡量剪碎鰭條，加入裂解液和蛋白酶K混勻，于55 ℃搖床中消化至溶液澄清透明。再向裂解液中加入RNase于37 ℃水浴鍋中保溫1 h。然后按傳統(tǒng)的酚、三氯甲烷、異戊醇法提取基因組DNA。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和完整性，用紫外分光光度計檢測質(zhì)量濃度，并稀釋至50 ng/μL，存于-20 ℃冰箱中待用。

微衛(wèi)星引物序列參照文獻[7]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息見表1。PCR反應(yīng)體系總體積25 μL：10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，引物2 μL，50 ng/μL DNA 2 μL，rTaq0.2 μ L，ddH2O 17.3 μL。PCR擴增反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58～70 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃終止延伸 5 min。PCR擴增產(chǎn)物用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，硝酸銀染色，數(shù)碼相機拍照。

利用Popgen 1.32軟件統(tǒng)計所有位點的等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度。利用Cervus 3.0軟件分析多態(tài)信息含量。利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建不同群體的非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，簡稱UPGMA)親緣關(guān)系樹。

表16個微衛(wèi)星位點引物序列及退火溫度

注：F為正向引物，R為反向引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通黃顙魚、瓦氏黃顙魚及雜交黃顙魚(普通黃顙魚♀×瓦氏黃顙魚群體遺傳特征

參考文獻[7]的9對微衛(wèi)星引物中，有6對引物(表1)能在普通黃顙魚、瓦氏黃顙魚及雜交黃顙魚中擴增出清晰條帶，擴增條帶為90～460 bp。其中，引物AG240表現(xiàn)為種間特異性擴增，即普通黃顙魚與瓦氏黃顙魚的擴增條帶間存在明顯差異。雜交黃顙魚均顯示2個條帶，表現(xiàn)為親本普通黃顙魚與瓦氏黃顙魚的雜交組合帶(圖1)。

普通黃顙魚、瓦氏黃顙魚、雜交黃顙魚的等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、多態(tài)信息含量見表2。6個座位中，每個位點的等位基因數(shù)為1～9個。普通黃顙魚與瓦氏黃顙魚在6個座位中除了AG240位點表現(xiàn)為單態(tài)，其余5個位點均表現(xiàn)為多態(tài)。瓦氏黃顙魚群體有效等位基因數(shù)為3.026 8個(表中未列)、觀測雜合度為0.349 0、多態(tài)信息含量為0.508 0，均高于普通黃顙魚群體[有效等位基因數(shù)為2.008 2個(表中未列)、觀測雜合度為 0.109 4、多態(tài)信息含量為0.320 3]。

雜交黃顙魚有效等位基因數(shù)(2.863 2個，表中未列)、觀測雜合度(0.338 5)、多態(tài)信息含量(0.501 2)高于母本普通黃顙魚，低于父本瓦氏黃顙魚。

表2普通黃顙魚、瓦氏黃顙魚、雜交黃顙魚的遺傳多樣性參數(shù)

注：Na為等位基因數(shù)；Ho為觀測雜合度；He為期望雜合度；PIC為多態(tài)信息含量。

根據(jù)Nei’s上計算所得群體間遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離，由表3可以看出，雜交黃顙魚與母本普通黃顙魚遺傳相似度最高，為0.673 1，遺傳距離最小，為0.395 9；雜交黃顙魚與父本瓦氏黃顙魚遺傳相似度居中，為0.542 1，遺傳距離也居中，為0.612 4；父本瓦氏黃顙魚與母本普通黃顙魚遺傳相似度最小，為0.249 2，遺傳距離最大，為1.389 6。

表3普通黃顙魚、瓦氏黃顙魚和雜交黃顙魚

注：對角線以下為遺傳距離，對角線以上為遺傳相似性系數(shù)。

根據(jù)群體間的Nei’s遺傳距離，采用MEGA 4軟件構(gòu)建普通黃顙魚、瓦氏黃顙魚和雜交黃顙魚群體間的親緣關(guān)系UPGMA樹(圖2)，可見雜交黃顙魚(zjh)和母本普通黃顙魚(pth)先聚為一支，再與父本瓦氏黃顙魚(wsh)聚合。

2.2 微衛(wèi)星位點親子代間遺傳傳遞

采用PopGene32軟件對普通黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交1代群體基因條帶進行統(tǒng)計、分析。由表4可以看出，普通黃顙魚群體的基因型為1～9種，瓦氏黃顙魚群體的基因型為1～9種，雜交子1代的基因型為1～14種。從各個微衛(wèi)星位點看，雜交子1代的基因型種類與父本瓦氏黃顙魚相當(dāng)或略豐富(除去CT154位點)，且普遍比母本普通黃顙魚基因型種類豐富。

表4普通黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交1代中基因型頻率分布

注：A、B、C、D、E、F、G、H、I代表等位基因。

3 討論與結(jié)論

3.1 普通黃顙魚、瓦氏黃顙魚及雜交黃顙魚群體遺傳多樣性

3.2 種質(zhì)資源鑒定

種質(zhì)資源鑒定對探明物種和遺傳資源有很重要的意義，是一項非?；A(chǔ)性的工作。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征作為鑒別依據(jù)在有些情況下很困難[12]，如黃顙魚屬的不同種魚在形態(tài)上很相似，很難區(qū)別，尤其是處于早期生活史階段的魚苗及幼魚。用同工酶法容易受到自然環(huán)境的影響[13]，而利用DNA分子標(biāo)記則很少受到自然環(huán)境的限制，具有較高多態(tài)性的RAPD方法增加了種內(nèi)和種間鑒定的可行性[14-15]。趙文學(xué)等采用RAPD方法對4種黃顙魚進行了鑒定，篩選出6個引物可以用來準(zhǔn)確鑒別黃顙魚屬的4種魚類[10]。本研究采用SSR方法對普通黃顙魚、瓦氏黃顙魚和它們的雜種1代進行了遺傳多樣性分析，篩選出1個引物(AG240)可以準(zhǔn)確鑒別這3種魚。

參考文獻：

[1]胡大雁，周志金，朱 強，等. 雜交黃顙魚和普通黃顙魚抗鲇魚愛德華氏菌病能力的評價[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚，2016(11)：54-55.

[2]王明寶，陳 強，陳耀炳，等. 黃顙魚與瓦氏黃顙魚雜交技術(shù)研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012(24)：273-273，278.

[6]唐忠林，周國勤，茆健強，等. 黃顙魚與瓦氏黃顙魚的規(guī)?；s交繁殖[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44(10)：303-305.

[7]吳勤超，梁宏偉，李 忠，等. 黃顙魚微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選及三個野生群體的遺傳結(jié)分析[J]. 生物技術(shù)通報，2010(3)：154-159.

[8]趙哲霞，蔣 珊，王濱花，等. 黃顙魚屬SSR分子鑒定及其遺傳多樣性[J]. 南昌大學(xué)學(xué)報(理科版)，2014，38(5)：498-501.

[9]肖調(diào)義，張學(xué)文，章懷云，等. 洞庭湖四種黃顙魚基因組DNA遺傳多樣性的RAPD分析[J]. 中國生物工程雜志，2004，24(3)：84-89.

[10]趙文學(xué)，楊 星，彭 智，等. 黃顙魚屬物種的RAPD分子鑒定及雜種遺傳分析[J]. 水生生物學(xué)報，2006，30(1)：101-106.

[11]Botstein D，White R L，Skolnick M，et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. The American Journal of Human Genetics，1980，32(3)：314-331.

[12]Briolay J，Galtier T，Brito R M，et al. Molecular phylogeny of Cyprinidae inferred from cytochrome b DNA sequences[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，1998，9(1)：100-108.

[13]Caccone A，Allegrucci G，F(xiàn)ortunato C，et al. Genetic differentiation within the European see bass(D.labrax)as revealed by RAPD-PCR assays[J]. Journal of Heredity，1997(88)：316-324.

[14]Williams J G，Kubelik A R，Livak K J，et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J]. Nucleic Acids Research，1990，18(22)：6531-6535.

[15]Haymer D S，McInnis D O. Resolution of populations of the Mediterranean fruit fly at the DNA level using random primers for the polymerase chain reaction[J]. Genome，1994，37(2)：244-248.