乙醛脫氫酶基因表達載體的構建及表達條件篩選

張傳麗， 高明俠， 董玉瑋， 王 陶， 李同祥， 高兆建

(1.徐州工程學院江蘇省食品資源開發(fā)與質量安全重點建設實驗室，江蘇徐州 221008；2.徐州工程學院江蘇省食品安全生物芯片檢測技術工程實驗室，江蘇徐州 221008)

3-羥基丙酸(3-hydroxypropionic acid，3-HP)是一種具有3個碳原子的非手性液態(tài)有機酸，是一種重要的化學中間體，是很多光學活性物質的合成前體，具有重大的開發(fā)價值[1-2]。傳統(tǒng)的化學合成法生產3-HP常具有能耗高、污染大、副產物多、分離困難等缺點，而生物方法生產3-HP則可以有效地避免這些不利因素，因此采用生物方法制備3-HP成為現(xiàn)在國際上最注目的研究熱點之一[3]。

乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)是一種廣泛存在于原核生物和真核生物中的氧化還原酶，可將多種脂肪族醛和芳香族醛氧化生成相應的脂肪族酸和芳香族酸[4-5]。ALDH是微生物發(fā)酵生產3-HP過程中的關鍵酶之一，具有重要的研究意義。

本研究以釀酒酵母中的ALDH為對象，將從釀酒酵母中克隆到的ALDH基因連接到pET30a(+)表達載體中，構建ALDH基因的原核表達載體，得到含有pET30a-ALDH重組質粒的轉基因菌株，并分析不同培養(yǎng)條件下ALDH催化反應的活性差異。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

大腸桿菌E.coliDH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細胞購買自上海邁其生物科技有限公司；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) W303-1A來源于山東大學鮑曉明教授實驗室；pMD18-T克隆載體購買自寶生物工程(大連)有限公司；pET30a(+)表達載體來源于江蘇沿海地區(qū)農業(yè)科學研究所。

1.2 酶和試劑

BamHⅠ、SacⅠ、T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker等購買自寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒購買自北京艾德萊生物科技有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：酵母膏1%(質量濃度)，蛋白胨2%(質量濃度)，葡萄糖2%(質量濃度)；LB培養(yǎng)基：酵母膏0.5%(質量濃度)，蛋白胨1%(質量濃度)，NaCl 1%(質量濃度)。

1.4 重組質粒pET30a-ALDH構建

以釀酒酵母基因組DNA為模板、以Primer-F和Primer-R為引物進行釀酒酵母ALDH基因克隆。其PCR反應體系見表1。

表1釀酒酵母ALDH基因PCR反應體系

PCR反應程序為98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

PCR反應產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收，與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，菌落PCR篩選轉化成功的pMD18-T-ALDH重組質粒。其菌落PCR反應體系見表2。

表2pMD18-T-ALDH重組質粒菌落PCR反應體系

PCR反應程序為94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，28個循環(huán)；72 ℃ 1 s。

pMD18-T-ALDH重組質?；厥蘸?，進行BamHⅠ 和SacⅠ雙酶切；酶切產物回收、純化之后連接到同樣雙酶切、純化后的pET30a(+)載體上，連接產物轉化宿主菌DH5α和BL21(DE3)，經PCR檢測、酶切和測序驗證ORF正確的克隆用于ALDH蛋白表達。

1.5 乙醛脫氫酶活力測定

ALDH酶催化反應液成分見表3。

表3ALDH酶催化反應液成分

將0.5 mL酶液與1 mL上述反應液混合，反應體系在 25 ℃ 下保溫5 min，在340 nm波長下測其吸光度[8-11]。

酶活單位定義：標準反應條件下，1 min催化生成1 mmol NADH所需要的酶量被定義為1個活力單位(U)。

1.6 ALDH在Escherichia coli BL21(DE3)中的表達

將含重組質粒的大腸桿菌菌株接種單菌落于LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素30 μg/L)中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)10～12 h 至菌液D600 nm值達到0.6～0.9后，分別加入終濃度為 0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，于150 r/min條件下進行ALDH酶蛋白誘導培養(yǎng)。誘導培養(yǎng)的溫度分別為28 ℃和 37 ℃，培養(yǎng)時間分別為0、2、4、6、8 h。離心收集菌體，稱量菌體濕質量。

1.7 大腸桿菌細胞的破碎

取0.5 g濕菌體，懸浮于含2 mmol/L的二硫蘇糖醇的 10 mL 磷酸緩沖液中，冰上超聲波破碎菌體(功率400 W，工作2 s，間隔3 s，40次)，8 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清液，即為ALDH粗酶液[9]。

2 結果與分析

2.1 重組表達質粒的構建

以釀酒酵母W303-1A基因組DNA為模板、以Primer-F和Primer-R為引物，進行釀酒酵母ALDH基因的PCR克隆，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，發(fā)現(xiàn)本試驗中克隆得到的條帶大小與預期的基因片段大小一致，約1.6 kb，如圖1所示。

將上述PCR產物經瓊脂糖凝膠回收后，連接到pMD18-T克隆載體上，轉化，并將得到的pMD18-T-ALDH重組質粒進行BamHⅠ和SacⅠ雙酶切驗證(圖2)。

將測序正確的pMD18-T-ALDH重組質粒用BamHⅠ和SacⅠ雙酶切，回收酶切產物，將回收產物與經BamHⅠ和SacⅠ 雙酶切的pET30a(+)表達載體相連，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)和BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經菌落PCR篩選(圖3)后，將篩選得到的陽性單菌落送樣測序，得到含有與文獻報道的ALDH基因大小一致的E.coliBL21(pET30a-ALDH)重組菌株。

2.2 不同IPTG誘導培養(yǎng)濃度對乙醛脫氫酶活性的影響

挑取轉化成功的E.coliBL21(pET30a-ALDH)菌株的少量菌體于LB液體培養(yǎng)基(含30 μg/L卡那霉素)中 37 ℃、180 r/min培養(yǎng)10～12 h至菌液D600 nm值達到0.6～0.9 后，分別加入終濃度為0、0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L的IPTG，然后于28 ℃ 150 r/min條件下誘導培養(yǎng)6 h后，測定誘導產生的ALDH酶蛋白的催化活性，結果如圖4所示。以相同條件下培養(yǎng)的E.coliBL21(pET30a)為對照。

從圖4中可明顯看出，E.coliBL21(pET30a-ALDH)菌株在IPTG誘導濃度增加時，ALDH酶催化的相對活性也在逐步增大，當IPTG誘導濃度為1.0 mmol/L時，ALDH酶催化的相對活性是最高的，可達30.2 U/mL。

本試驗中的對照菌株E.coliBL21(pET30a)也檢測到了一定的乙醛脫氫酶催化反應活性，說明E.coliBL21(DE3)細胞中是攜帶有醛脫氫酶基因的，這與其他研究者的研究結果[8，10]是一致的。

2.3 不同誘導時間對乙醛脫氫酶活性的影響

E.coliBL21(pET30a-ALDH)菌株于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)至D600 nm值為0.6～0.9后，加入終濃度1.0 mmol/L的IPTG，然后于28 ℃、150 r/min條件下分別誘導培養(yǎng)0、2、4、6、8 h后，測定誘導產生的ALDH酶蛋白的催化活性，測定結果如圖5所示。以相同條件下培養(yǎng)的E.coliBL21(pET30a)為對照。

從圖5中可明顯看出，28 ℃、150 r/min條件下誘導培養(yǎng)時間越長，ALDH酶催化的相對活性越高，誘導培養(yǎng)6 h時，ALDH的相對酶活性達到最高，高達30.2 U/mL，其中，誘導培養(yǎng)2 h之內，ALDH的相對酶活性增長最快；6 h后，隨著誘導時間的延長，ALDH的相對酶活性反而有所下降，其原因可能是ALDH酶活性半衰期較短，當誘導時間較長時，誘導表達的ALDH酶蛋白部分被降解或失活。

2.4 不同誘導溫度對乙醛脫氫酶活性的影響

E.coliBL21(pET30a-ALDH)菌株于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)至D600 nm值為0.6～0.9后，加入終濃度1.0 mmol/L的IPTG，分別于28 ℃、150 r/min和37 ℃、150 r/min條件下誘導培養(yǎng)6 h后測定誘導產生的ALDH的酶催化活性。分析發(fā)現(xiàn)，當誘導溫度為28 ℃時，ALDH酶的相對活性明顯高于誘導溫度為37 ℃時的相對活性(圖6)，其原因可能是誘導溫度升高時，產生的包涵體增多，使得可溶性的ALDH濃度降低，或者ALDH酶對溫度很敏感，高溫使部分酶失活或鈍化了。

3 結論

本試驗首先通過PCR技術從釀酒酵母基因組DNA中克隆得到長度約1.6 kb的乙醛脫氫酶基因的ORF序列，并將其連入pET30a(+)表達載體中，成功構建了釀酒酵母乙醛脫氫酶基因的原核表達載體；同時對構建的釀酒酵母乙醛脫氫酶基因的原核表達載體在宿主細胞大腸桿菌BL21(DE3)中的誘導表達條件進行篩選，發(fā)現(xiàn)誘導表達的乙醛脫氫酶催化活性受到誘導物IPTG濃度、誘導表達時間和誘導溫度的影響，當IPTG濃度為1.0 mmol/L、誘導時間為6 h、誘導溫度為 28 ℃ 時，誘導表達出的乙醛脫氫酶相對酶活性最高，可達30.2 U/mL。目前本課題組正在對釀酒酵母ALDH基因進行突變試驗，期望能得到活性更高、耐適性更好的ALDH酶，以提高微生物發(fā)酵生產3-HP的效率。

參考文獻：

[1]Gregory G L，López-Vidal E M，Buchard A. Polymers from sugars：cyclic monomer synthesis，ring-opening polymerisation，material properties and applications[J]. Chemical Communications，2017，53(14)：2198-2217.

[2]張鴻達，劉 成，高衛(wèi)華，等. 微生物發(fā)酵法生產3-羥基丙酸的研究進展[J]. 化工進展，2007，26(1)：33-36.

[3]樓 堅，裘娟萍. 生物法合成3-羥基丙酸的研究進展[J]. 工業(yè)微生物，2006，36(4)：56-60.

[4]李 鑫，毛跟年. 乙醛脫氫酶提取工藝與活性研究[D]. 西安：陜西科技大學，2011.

[5]黃 瑞，王 璐，沈 微，等. 釀酒酵母乙醛脫氫酶的克隆與表達[J]. 工業(yè)微生物，2009，39(1)：22-27.

[6]邢福國，張培軍，譚訓剛，等. 酵母基因組的提取[J]. 食品科學，2007，28(3)：210-212.

[7]Lucas S，Copeland A，Lapidus A，et al. Direct Submission[DB]. Walnut Creek：US DOE Joint Genome Institute，2009.

[8]胡 南，繆鑫昕，談曙明，等. 重組大腸桿菌生物轉化甘油生產3-羥基丙酸[J]. 生物技術，2012，22(1)：72-75.

[9]張傳麗，陳 鵬. 銀杏類黃酮生物合成關鍵酶基因GbUFGT和GbFOMT的克隆、表達與功能分析[D]. 揚州：揚州大學，2012.

[10]丁月月，朱建國，李 霜. 大腸桿菌醛脫氫酶基因在Klebsiellapneumoniae中的克隆及表達優(yōu)化[C]//第六屆全國化學工程與生物化工年會論文集. 北京：中國化工學會，2010.

[11]趙玉鳳，吳元欣. 乙醛脫氫酶基因克隆及酶功能研究[D]. 武漢：華中農業(yè)大學，2009.