單核樣髓系來源抑制細(xì)胞在酒精性肝病進(jìn)展中的特點(diǎn)研究

高苗苗，孫子健，張紀(jì)元，鄒正升

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease,ALD）是長期大量飲酒或短期酗酒引起的肝損傷，最初表現(xiàn)為酒精性脂肪變性，進(jìn)而發(fā)展為酒精性肝炎（alcoholic hepatitis,AH）、酒精性肝硬化（alcoholic cirrhosis,ALC），甚至肝細(xì)胞癌[1-3]。ALD的發(fā)病機(jī)制包括乙醇及其代謝產(chǎn)物的直接肝毒性，氧化應(yīng)激損傷，腸源性內(nèi)毒素激活Kupffer細(xì)胞以及免疫功能失調(diào)等[3-4]。近年來，大量研究表明，免疫反應(yīng)在ALD的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用，例如活化的Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生肝保護(hù)性因子IL-6和抗炎因子IL-10；另一方面，Kupffer細(xì)胞激活產(chǎn)生大量

TNF-α等促炎因子，引起肝臟炎癥反應(yīng)和損傷[5]。乙醇還可抑制NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，削弱其抗纖維化功能[6]。單核樣髓系來源抑制細(xì)胞（monocytic myeloid derived suppressor cells,mMDSCs）作為髓系來源的抑制細(xì)胞的亞群，可通過精氨酸酶-1，活性氧類及ERK/IL-6/STAT3信號通路等多種途徑，在肝癌、乙型肝炎（乙肝）、丙型肝炎（丙肝）等多種肝病中發(fā)揮著免疫抑制作用[7-9]。本文通過檢測ALD患者外周血mMDSCs頻率及其精氨酸酶的表達(dá)水平，探討mMDSCs與ALD的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 對象 所有ALD研究對象均來自2016年7月—2017年7月就診于解放軍第三〇二醫(yī)院的患者。ALD患者79例（ALD組），其中輕癥酒精性肝炎（mild alcoholic hepatitis,MAH）患者11例、ALC患者68例，其中63例ALD患者檢測了其胞內(nèi)精氨酸酶，包括MAH 9例，ALC 54例。另外入選23例健康人群作為健康對照（healthy control,HC）。入組患者均為男性。ALD患者診斷均符合《酒精性肝病診療指南》（2010年修訂版）的標(biāo)準(zhǔn)[1]。ALD臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：①有長期飲酒史，一般超過5年，折合乙醇量男性≥40 g/d，女性≥20 g/d，或2周內(nèi)有大量飲酒史，折合乙醇量＞80 g/d；②臨床癥狀為非特異性，可無癥狀，或有右上腹脹痛、食欲不振、乏力、體質(zhì)量減輕、黃疸等，隨著病情加重，可有神經(jīng)精神癥狀、蜘蛛痣、肝掌等表現(xiàn)；③AST、ALT、TBIL等指標(biāo)升高，禁酒后這些指標(biāo)可明顯下降，通常4周內(nèi)基本恢復(fù)正常，AST/ALT＞2，有助于診斷；④肝臟B超或CT檢查有典型表現(xiàn)。⑤排除嗜肝病毒現(xiàn)癥感染以及藥物、中毒性肝損傷和自身免疫性肝病等。符合第1、2、3項和第5項或第1、2、4項和第5項可診斷ALD。符合ALD臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)者，其臨床分型診斷如下。AH：血清ALT、AST或γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶升高，可有血清TBIL增高。ALC：有肝硬化的臨床表現(xiàn)和血清生物化學(xué)指標(biāo)的改變，同時排除心、腦、腎和其他系統(tǒng)嚴(yán)重功能不全者及合并其他的嚴(yán)重疾病者。研究對象基本臨床資料見表1、2和3。

表1 HC、MAH、ALC 組年齡比較Table 1 Age comparison of group HC,MAH and ALC

表2 MAH、ALC組肝功能比較Table 2 Liver function comparison of MAH group and ALC group

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑 所用試劑為：肝素鈉抗凝采血管、CD14-APC-Cy7、細(xì)胞破膜劑（美國BD公司），小鼠抗人CD11b-APC、CD33-PE、HLA-DR-BV421、CD15-PerCP（美國Biolegend公司），Arginase I-FITC、Mouse IgG2B-FITC Isotype Contro（l美國R&D公司）。

1.2.2 儀器 所用儀器為：臺式高性能低溫離心機(jī)（美國Thermo公司），供應(yīng)臺式離心機(jī)LD5-2A（北京京立離心機(jī)有限公司），F(xiàn)ACS Verse型流式細(xì)胞儀（美國BD公司），低溫冰箱（日本SANYO公司），架盤天平（北京醫(yī)用天平廠），渦旋混合器（德國IKA公司）。

1.3 方法

1.3.1 Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs） 使用10 ml肝素鈉抗凝管采集新鮮的外周血，離心留存血漿后，用PBS稀釋至10 ml，加于4 ml淋巴細(xì)胞分離液上層（分2管），2500 r/min離心25 min。吸取白膜層于新的離心管中，PBS洗滌2遍去除殘留Ficoll液及血小板，得到高純度的PBMCs。

1.3.2 流式細(xì)胞檢測 ①將PBMCs計數(shù)后懸于PBS中。取106PBMCs于流式管中，并設(shè)立同型對照管。②加入CD11b、CD33、CD14、HLA-DR和CD15熒光抗體，震蕩混勻，室溫孵育20 min。③加1 ml PBS于流式管，震蕩混勻，1700 r/min離心4 min，棄上清。④加300 μl破膜劑于流式管，震蕩混勻，4 ℃避光孵育30 min。⑤PBS洗滌，步驟同③。⑥加精氨酸酶熒光抗體于檢測管，同型對照管加入精氨酸酶同型對照（Mouse IgG2BFITC Isotype Control），震蕩混勻，室溫孵育20 min。⑦PBS洗滌1次，同③。加200 μl 1%多聚甲醛固定，2～8 ℃避光保存。24 h內(nèi)上機(jī)檢測。使用Flowjo軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。用GraphPad Prism 6（美國GraphPad軟件公司）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)圖形繪制。定量資料呈正態(tài)分布者用±s表示，3組比較用單因素方差分析（組間方差齊），兩兩比較用q檢驗。定量資料為非正態(tài)分布者以中位數(shù)（最小值，最大值）表示，組間比較采用Mann-Whitney非參數(shù)秩和檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 ALC組Child-Pugh各級臨床資料Table 3 Clinical data comparison of ALC patients according to Child-Pugh classification

2 結(jié) 果

2.1 典型圈門流式圖 首先圈定了所有細(xì)胞，而后選定Live/Dead陰性細(xì)胞，即所有活細(xì)胞。圈定CD11b和CD33雙陽性細(xì)胞為髓源性細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上選定CD14陽性，HLA-DR陰性細(xì)胞為未成熟髓系單核細(xì)胞，進(jìn)一步圈定CD15陰性（排除粒細(xì)胞樣髓系來源抑制細(xì)胞），CD14陽性為 mMDSCs（CD11b+CD33+HLA-DRCD14+CD15-），見圖 1。

圖1 mMDSCs圈門策略Figure 1 Gating strategy for mMDSCs

2.2 ALD患者外周血mMDSCs頻率變化 與HC組外周血mMDSCs頻率[以占CD11b+CD33+CD14+細(xì)胞（即單核細(xì)胞）比例計算，下同]相比，ALD患者外周血mMDSCs頻率顯著上升，見表4。進(jìn)一步根據(jù)病情分組分析發(fā)現(xiàn)，ALC組mMDSCs頻率顯著高于HC組和MAH組，見表5。將ALC組根據(jù)Child-Pugh分級分組后發(fā)現(xiàn)，Child-Pugh C級mMDSCs頻率顯著高于Child-Pugh B級，與Child-Pugh A級無顯著差異，見表6。進(jìn)一步分析了ALD患者外周血mMDSCs頻率與中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio,NLR）發(fā)現(xiàn)2者呈弱正相關(guān)，見圖2。

表4 HC、ALD組外周血mMDSCs頻率比較Table 4 Peripheral mMDSCs frequency comparison of HC group and ALD group

表5 HC、MAH 、ALC組外周血mMDSCs頻率比較Table 5 Peripheral mMDSCs frequency comparison of group HC,MAH and ALC

2.3 ALD患者外周血精氨酸酶陽性mMDSCs頻率變化 HC組與ALD患者體內(nèi)均表達(dá)精氨酸酶，但ALD組mMDSCs胞內(nèi)精氨酸酶表達(dá)量高于同型對照組（以平均熒光強(qiáng)度值表示），見圖3A。進(jìn)一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，ALD組精氨酸酶陽性mMDSCs頻率顯著高于HC組，見表7。且MAH組精氨酸酶陽性mMDSCs頻率與ALC組精氨酸酶陽性mMDSCs頻率均顯著高于HC組，ALC組精氨酸酶陽性mMDSCs頻率高于MAH組，見表8。進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，ALD患者外周血精氨酸酶陽性mMDSCs頻率與NLR呈弱正相關(guān)，見圖3B。

表6 ALC Child-Pugh分級各級外周血mMDSCs頻率比較Table 6 Peripheral mMDSCs frequency comparison of Child-Pugh classification in ALC

圖2 ALD患者外周血mMDSCs頻率與NLR相關(guān)性Figure 2 Correlation between peripheral mMDSCs frequency and NLR in ALD patients

3 討 論

在腫瘤、各種急慢性感染及創(chuàng)傷等多種疾病狀態(tài)下，髓系細(xì)胞成熟分化受阻，停留在未成熟分化階段，并獲得免疫抑制能力，稱之為髓源性免疫抑制細(xì)胞（myeloid derived suppressor cells,MDSCs）。根據(jù)其表面標(biāo)志物的不同，分為mMDSC（CD11b+CD33+HLA-DR-CD14+CD15-）和 gMDSC（CD11b+CD33+HLA-DR-CD14-CD15+）兩群[10]。MDSCs可通過精氨酸酶、半胱氨酸、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，活性氧類及IL-6/STAT3信號通路等多種途徑發(fā)揮免疫抑制作用[7]。近年來多項研究表明，MDSCs在乙肝、丙肝、原發(fā)性膽汁性膽管炎、肝癌等多種肝疾病中發(fā)揮免疫抑制作用[8-15]，但其在ALD中的變化特點(diǎn)及與疾病進(jìn)展的關(guān)系尚未見報道。因此，本研究初步觀察了ALD患者外周血mMDSCs的頻率變化及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系。

圖3 精氨酸酶陽性mMDSCs頻率及與NLR相關(guān)性A.HC與ALD組外周血mMDSCs胞內(nèi)精氨酸表達(dá)量；B.ALD患者外周血精氨酸酶陽性mMDSCs頻率與NLR相關(guān)性Figure 3 Correlation between arginase+ mMDSC frequencies and NLR

表7 HC、ALD 組外周血精氨酸酶陽性mMDSCs頻率比較Table 7 Peripheral arginase+ mMDSCs frequency comparison of HC group and ALD group

表8 HC、MAH 、ALC組外周血精氨酸酶陽性mMDSCs頻率比較Table 8 Peripheral arginase+ mMDSCs frequency comparison of group HC,MAH and ALC

實驗結(jié)果顯示，隨著疾病進(jìn)展，ALD患者外周血mMDSCs頻率進(jìn)行性升高，表明mMDSCs可能在該病發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮作用。這與之前在肝癌[14]，乙肝[8]，丙肝[16]中的發(fā)現(xiàn)一致。Fang等[8]研究顯示，慢性乙肝患者mMDSCs頻率顯著升高，且與血漿HBsAg水平呈正比。HBsAg可通過ERKIL-6STAT3信號通路介導(dǎo)mMDSCs極化，極化的mMDSCs可抑制乙肝患者T細(xì)胞的活化。Ren等[16]在丙肝中的研究發(fā)現(xiàn)，丙肝患者M(jìn)DSCs頻率顯著增高，并與HCV RNA呈正相關(guān)。HCV可通過產(chǎn)生活性氧誘導(dǎo)MDSCs抑制T細(xì)胞反應(yīng)[9]。另有研究表明，HCV感染可誘導(dǎo)mMDSCs產(chǎn)生，并通過精氨酸酶途徑抑制NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ[12]。因此，為了闡釋mMDSCs在ALD的作用機(jī)制，我們進(jìn)一步檢測了mMDSCs胞內(nèi)的精氨酸酶表達(dá)量。與健康對照相比，ALD患者mMDSCs表達(dá)更多的精氨酸酶，且MAH組和ALC組精氨酸酶陽性mMDSCs均顯著高于HC組。但ALD患者mMDSCs是否通過精氨酸酶途徑發(fā)揮作用尚不清楚，須進(jìn)一步檢測釋放到血漿的精氨酸酶濃度及其底物精氨酸的濃度，以及進(jìn)行體外實驗驗證mMDSCs對ALD患者免疫細(xì)胞的抑制作用。

中性粒細(xì)胞增多和/或淋巴細(xì)胞減少為應(yīng)對不良應(yīng)激事件的生理應(yīng)答，高NLR表示機(jī)體存在亞臨床炎癥[17]。NLR通常比較穩(wěn)定，有研究顯示，NLR增高表明機(jī)體免疫紊亂[18]。本文研究發(fā)現(xiàn)，ALD患者mMDSCs及精氨酸酶陽性的mMDSCs與NLR呈弱正相關(guān)，提示mMDSCs與機(jī)體的免疫狀態(tài)具有一定相關(guān)性。

總之，研究發(fā)現(xiàn)ALD患者外周血mMDSCs顯著增多，并與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。本研究從另一個新的角度闡明了免疫反應(yīng)在ALD中可能的作用機(jī)制，也為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)提供了重要基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]厲有名，范建高，王炳元，等.酒精性肝病診療指南[J].臨床肝膽病雜志，2010，4(3):229-232.

[2]鄒正升，常彬霞.酒精性肝炎的診斷預(yù)后分析及治療的探討[J].傳染病信息，2015，28(5):312-316.

[3]Miller AM,Horiguchi N,Jeong WI,et al.Molecular mechanisms of alcoholic liver disease: innate immunity and cytokines[J].Alcohol Clin Exp Res,2011,35(5):787-793.

[4]Orman ES,Odena G,Bataller R.Alcoholic liver disease:pathogenesis,management,and novel targets for therapy[J].J Gastroenterol Hepatol,2013,28(Suppl 1):S77-S84.

[5]Voican CS,Perlemuter G,Naveau S.Mechanisms of the inflammatory reaction implicated in alcoholic hepatitis: 2011 update[J].Clin Res Hepatol Gastroenterol,2011,35(6-7):465-474.

[6]Gao B,Jeong WI,Tian Z.Liver: an organ with predominant innate immunity[J].Hepatology,2008,47(2):729-736.

[7]Ostrand-Rosenberg S,Sinha P.Myeloid-derived suppressor cells: linking inflammation and cancer[J].J Immunol,2009,182(8):4499-4506.

[8]Fang Z,Li J,Yu X,et al.Polarization of monocytic myeloid-derived suppressor cells by hepatitis B surface antigen is mediated via ERK/IL-6/STAT3 signaling feedback and restrains the activation of T cells in chronic hepatitis B virus infection[J].J Immunol,2015,195(10):4873-4883.

[9]Tacke RS,Lee HC,Goh C,et al.Myeloid suppressor cells induced by hepatitis C virus suppress T-cell responses through the production of reactive oxygen species [J].Hepatology,2012,55(2):343-353.

[10]Talmadge JE,Gabrilovich DI.History of myeloid-derived suppressor cells[J].Nat Rev Cancer,2013,13(10):739-752.

[11]Pallett LJ,Gill US,Quaglia A,et al.Metabolic regulation of hepatitis B immunopathology by myeloid-derived suppressor cells[J].Nature Medicine,2015,21(6):591-600.

[12]Goh CC,Roggerson KM,Lee HC,et al.Hepatitis C Virus-induced myeloid-derived suppressor cells suppress NK cell IFN-gamma production by altering cellular metabolism via arginase-1[J].J Immunol,2016,196(5):2283-2292.

[13]Zhang H,Lian M,Zhang J,et al.A functional characteristic of cysteine-rich protein 61: modulation of myeloid-derived suppressor cells in liver inflammation[J].Hepatology,2018,67(1):232-246.

[14]Arihara F,Mizukoshi E,Kitahara M,et al.Increase in CD14+HLADR-/low myeloid-derived suppressor cells in hepatocellular carcinoma patients and its impact on prognosis[J].Cancer Immunol Immunother,2013,62(8):1421-1430.

[15]Deng Y,Cheng J,Fu B,et al.Hepatic carcinoma-associated fibroblasts enhance immune suppression by facilitating the generation of myeloid-derived suppressor cells[J].Oncogene,2017,36(8):1090-1101.

[16]Ren JP,Zhao J,Dai J,et al.Hepatitis C virus-induced myeloidderived suppressor cells regulate T-cell differentiation and function via the signal transducer and activator of transcription 3 pathway[J].Immunology,2016,148(4):377-386.

[17]Lin B Y,Zhou L,Geng L,et al.High neutrophil-lymphocyte ratio indicates poor prognosis for acute-on-chronic liver failure after liver transplantation[J].World J Gastroenterol,2015,21(11):3317-3324.

[18]Zahorec R.Ratio of neutrophil to lymphocyte counts--rapid and simple parameter of systemic inflammation and stress in critically ill[J].Bratisl Lek Listy,2001,102(1):5-14.