基于光譜和氣味特征信息的霉變大米無損檢測

沈 飛 張 斌 劉 瀟 黃 怡 趙天霞 魏穎琪

(江蘇高?，F(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心；江蘇省高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實驗室；南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，南京 210023)

大米是稻谷經(jīng)清理、礱谷、碾米、成品整理等工序后制成的成品，相較于有稻殼保護(hù)的稻谷，大米更易受霉菌侵染而霉變。大米霉變不僅造成糧食損失及品質(zhì)下降，其菌落代謝產(chǎn)生的黃曲霉毒素、伏馬菌素等真菌毒素更是給人畜健康帶來嚴(yán)重的威脅[1-4]。因此，實現(xiàn)大米霉變的早期快速鑒定尤為重要。

目前，谷物霉變的檢測方法主要有熒光染色法[5]、干片培養(yǎng)法[6]、微生物酶活性法[7]、高效液相色譜法[8]、免疫層析法[9]等。然而，這些傳統(tǒng)的霉變檢測方法普遍較為繁瑣、耗時，難以滿足現(xiàn)場實時檢測的需求。以近、中紅外光譜和電子鼻分析技術(shù)為代表的無損分析技術(shù)，具有無需樣品預(yù)處理、測定時間短、不使用化學(xué)試劑、可同時測定多種目標(biāo)參數(shù)等優(yōu)點(diǎn)，在谷物霉菌侵染快速鑒定方面獲得了越來越廣泛的應(yīng)用。

Fu等[10]利用近紅外光譜結(jié)合PCA、 LDA和PLS-DA數(shù)據(jù)處理方法對向日葵的霉變狀況及貨架期進(jìn)行了分析，其中PLS-DA霉變識別模型的判別準(zhǔn)確度最高，可達(dá)到100%。Wang等[11]利用近紅外光譜結(jié)合PLS、ANN方法對健康大豆和受真菌感染大豆進(jìn)行了區(qū)分，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的分類準(zhǔn)確度要高于PLS，驗證集總體準(zhǔn)確率達(dá)94.6%。Du等[12]利用中紅外光譜技術(shù)對感染白粉病的樹莓樣品進(jìn)行識別，發(fā)現(xiàn)健康樹莓葉片和染病葉片的光譜特征存在顯著差異。殷勇等[13]利用電子鼻對玉米霉變程度進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)多特征值組合的鑒別效果優(yōu)于單特征值，使用3個特征值時鑒別效果最佳，正確率達(dá)96%以上。

為進(jìn)一步探索近、中紅外光譜與電子鼻分析技術(shù)的應(yīng)用潛力，比較不同方法用于糧食樣品檢測的優(yōu)劣，本研究以大米為研究對象，分析其受霉菌感染所產(chǎn)生的特征光譜和氣味信息，結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法，建立大米受不同霉菌侵染種類及侵染程度的同步檢測模型，并比較不同技術(shù)所建模型性能的差異，以期為實現(xiàn)糧食樣品霉菌狀態(tài)的快速識別和早期預(yù)警提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及樣品處理

福臨門新鮮粳米樣品(產(chǎn)地：江蘇)購自當(dāng)?shù)爻?，放?℃冷藏儲存?zhèn)溆?。選擇4種谷物中常見產(chǎn)真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)菌株：黃曲霉3.17、黃曲霉3.3950、寄生曲霉3.3950、赭曲霉3.6486(中國北京北納創(chuàng)聯(lián)研究院)，將菌株培養(yǎng)后制成濃度約105CFU/mL霉菌的孢子菌液備用。

將大米經(jīng)80 ℃、2h熱烘滅菌處理，測定樣品初始水分含量，加無菌水將樣品水分調(diào)節(jié)至20%，密封于4 ℃冷藏2 d平衡水分。將大米樣品分為150份進(jìn)行菌液接種，每份準(zhǔn)確稱取150 g。每種菌液接種30份大米樣品，在每份大米樣品表面接種5 mL相應(yīng)菌液，余30份大米樣品作為對照組并加入5 mL無菌水，攪拌均勻后將大米分別放置不同的人工氣候箱中并于28 ℃、80%RH的儲藏10 d。

1.2 實驗儀器

MB3600型傅里葉變換近紅外光譜儀：加拿大Quebec公司；InGaAs光電檢測器：加拿大ABB-Bomem公司；Tensor27型傅里葉變換紅外光譜儀：德國Bruker公司；ZnSe衰減全反射附件：美國Pike公司；Fox 3000型電子鼻：法國Alpha MOS公司。

1.3 方法

1.3.1 近、中紅外光譜采集

樣品從接種霉菌起，選取時間節(jié)點(diǎn)0、2、4、7、10 d，隨機(jī)選取受4種霉菌侵染大米各6份，并從對照組中隨機(jī)選取6份進(jìn)行光譜和氣味信息采集。為了使霉菌分布更加均勻，采用高速萬能粉碎機(jī)將每份樣品磨成粉狀，過40目篩，樣品放入密封袋中于4 ℃冷藏備用。在檢測前將冷藏的樣品置于室溫下約1 h直至樣品達(dá)到室溫。

運(yùn)用MB3600型傅里葉變換近紅外光譜儀和InGaAs 光電檢測器采集樣品近紅外光譜信息。掃描波數(shù)范圍為12 000～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為64次，樣品重復(fù)掃描3次，采集模式為漫反射。運(yùn)用Tensor27型傅里葉變換中紅外光譜儀45 ℃ ZnSe 衰減全反射附件( ATR )采集樣品的中紅外光譜信息。取約1 g樣品置于ATR 附件的ZnSe 晶體上，以空氣為背景進(jìn)行檢測，樣品重復(fù)掃描3次。掃描波數(shù)范圍為4 000～600 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描64次。

1.3.2 電子鼻信號采集

取5.00 g樣品于20 mL頂空瓶中，每個樣品6個平行。電子鼻檢測器參數(shù)條件，載氣流速：150 mL/min，采樣體積：1 mL，采樣速度：1 mL/s，采樣時間：60 s，采樣頻率：1次/s，保溫室溫度：60 ℃，保溫時間：120 s，振蕩速度：500 r/min。

1.3.3 樣品霉菌菌落總數(shù)測定

在不同儲藏時間節(jié)點(diǎn)，從受每種霉菌感染的6份樣品中隨機(jī)選取2份樣品進(jìn)行霉菌菌落總數(shù)的測定，參照國標(biāo)GB/T 4789.15—2010進(jìn)行測定。

1.4 實驗數(shù)據(jù)處理

采用TQ Analyst v 6.2.1 和SPSS v16.0軟件對大米的光譜和電子鼻氣味信息數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。通過主成分分析PCA、線性判別分析LDA建立定性區(qū)分模型，運(yùn)用交互驗證、外部驗證法和判別正確率等指標(biāo)對模型性能進(jìn)行綜合評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 大米樣品中菌落總數(shù)的變化

受4種不同霉菌侵染大米樣品中平均菌落總數(shù)變化如圖1所示。結(jié)果表明，隨儲藏時間增加，大米霉變程度不斷加深。由圖1可知，4種霉菌在0～4 d時生長較為平緩，此時的霉菌生長處于延滯期并需要適應(yīng)新的環(huán)境。但在4～10 d時，隨著儲藏時間的增加，大米中霉菌生長處于對數(shù)期，霉菌菌落總數(shù)呈較快的遞增趨勢，到后期大米樣品已發(fā)生嚴(yán)重霉變，4種霉菌生長速度整體差異不大。

圖1 受4種霉菌感染大米樣品中霉菌菌落總數(shù)變化趨勢

2.2 近紅外和中紅外光譜分析

圖2 受4種有害霉菌侵染大米樣品的近紅外原始光譜圖

圖3 受4種有害霉菌侵染大米樣品的中紅外原始光譜圖

接種不同霉菌大米在4 000～600 cm-1波段范圍內(nèi)中紅外光譜整體也較為相似(圖3)，但光譜吸收值同樣存在一定差異。其中3 290 cm-1處對應(yīng)于水分子中—OH的拉伸振動，霉菌生長過程需要水分參與，由圖可知不同霉菌樣品對水分影響較大。1 600～1 555 cm-1附近對應(yīng)于氨基酸中的COO的伸縮振動，而1 640和1 538 cm-1附近則與蛋白質(zhì)C—N伸縮振動有關(guān)。觀察可知，感染霉菌樣品在這兩處發(fā)生了較為明顯變化。原因可能在于霉菌中的水解酶導(dǎo)致大米蛋白質(zhì)發(fā)生水解反應(yīng)。其中，寄生曲霉組吸光度最小，赭曲霉次之，黃曲霉的吸光度最大，可能是寄生曲霉對蛋白質(zhì)的消耗較大，黃曲霉對蛋白質(zhì)的消耗較少，還需要進(jìn)一步研究。900～1 300 cm-1波段處吸收主要由淀粉引起[18-20]。霉菌生長代謝所需要的能量主要通過水解淀粉等糖類物質(zhì)提供，因而不同霉菌對光譜特征產(chǎn)生不同影響。

2.3 電子鼻響應(yīng)信號分析

圖4為大米樣品在10 d的電子鼻響應(yīng)信號雷達(dá)圖。由圖4可知，受不同霉菌侵染大米的電子鼻原始信號整體較為相似，但存在一定差異。觀察可知，傳感器T30/1、P10/1、P10/2、P40/1對于受不同霉菌侵染的大米產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)最為敏感，傳感器T70/2、PA/2較敏感。根據(jù)各傳感器特性分析可知[21]，受不同霉菌侵染的大米產(chǎn)生碳?xì)浠衔铩⒎枷阕寤衔?、有機(jī)胺等揮發(fā)性物質(zhì)存在一定差異，觀察可得，傳感器P10/1、P10/2、P40/1對感染黃曲霉3.17和赭曲霉3.648 6大米最敏感，而感染黃曲霉3.395 0大米敏感度較低?？傊?，不同霉菌代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性氣味特征差異為電子鼻的分析檢測提供了可能。

圖4 受4種有害霉菌感染大米樣品的電子鼻信號雷達(dá)圖

2.4 主成分分析結(jié)果

基于近紅外、中紅外光譜和電子鼻信號的大米樣品在不同儲藏階段(不同霉變程度)的主成分得分圖如圖5所示?？傮w而言，不同霉變程度大米樣品在主成分得分圖上區(qū)別并不十分顯著，表明霉菌感染引起的變化可能十分復(fù)雜，不同霉菌生長代謝所產(chǎn)生的物理、化學(xué)和氣味變化可能存在相互干擾。

仔細(xì)觀察可知，不同霉變程度樣品的近、中紅外光譜的主成分?jǐn)?shù)據(jù)點(diǎn)分布存在一定規(guī)律：在0、2 d數(shù)據(jù)點(diǎn)分布較為集中且存在部分重疊，均處于右側(cè)位置，可能因為大米剛受霉菌侵染，短期內(nèi)并沒有很大變化；4 d數(shù)據(jù)點(diǎn)分布分散且與7 d有部分重疊，這可能是因為霉菌在接種之后已適應(yīng)環(huán)境開始生長；7、10 d數(shù)據(jù)點(diǎn)分布較為分散且相互有重疊，主要位于中間和偏右側(cè)位置，這可能與霉菌的不同生長狀況有關(guān)。電子鼻信號的主成分?jǐn)?shù)據(jù)點(diǎn)分布優(yōu)于近/中紅外光譜：0、2 d數(shù)據(jù)點(diǎn)分布集中且相鄰，位于上面偏右位置，這可能是因為大米受霉菌侵染初期霉菌生長較緩，產(chǎn)生的氣味物質(zhì)相似；4 d數(shù)據(jù)點(diǎn)分布較廣且分散，但鮮有重疊，這可能是因為霉菌已適應(yīng)環(huán)境開始生長，產(chǎn)生不同的揮發(fā)性物質(zhì)；7 d數(shù)據(jù)點(diǎn)分布較為集中，位于中部右側(cè)，與其他時間節(jié)點(diǎn)均有少量重疊，這可能是因為這一時段霉菌大量繁衍，霉菌處于不同的生長狀況，產(chǎn)生的氣味物質(zhì)有所相似；10 d時數(shù)據(jù)點(diǎn)分布集中，位于下方右側(cè)。

圖5 不同霉變程度大米樣品的主成分分析結(jié)果

2.5 判別分析結(jié)果

2.5.1 受不同霉菌感染大米樣品LDA模型判別分析結(jié)果

運(yùn)用從主成分分析中提取的前10個主成分得分建立LDA判別模型。從空白和每種菌株感染樣品中隨機(jī)選取2/3樣品建立模型，其余1/3樣品用于驗證。將所有樣品劃分為空白和受4種霉菌感染共5類，表1為不同儲藏階段空白與受4種不同有害霉菌感染大米樣品的判別結(jié)果。由表1可知，3種方法建模集的整體判別正確率較高，達(dá)98.0%以上，表明不同霉菌與其所產(chǎn)生的光譜和氣味信息存在較高相關(guān)性。預(yù)測集中，近紅外和中紅外判別錯誤率較高，且主要集中在前期(0和2 d)，主要由于在大米感染霉菌初期，霉菌活動引起的光譜差異還未顯著。到感染后期，樣品光譜存在較大差異，正確率達(dá)90%以上。電子鼻方法的預(yù)測精度最高，整體準(zhǔn)確率為92.0%，表明霉菌代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性成分差異比光譜信息更加顯著。結(jié)果表明，雖然本研究中所接種的霉菌均為曲霉菌株，但其代謝所產(chǎn)生的光譜和氣味信息存在一定差異，可實現(xiàn)不同菌屬的有效區(qū)分。

表1 大米樣品受4種不同有害霉菌感染的LDA模型的建立與驗證結(jié)果

2.5.2 不同儲藏階段大米樣品LDA模型判別結(jié)果

根據(jù)儲藏時間的不同，將大米樣品劃分為5個霉變階段。表2為不同霉變階段大米樣品的LDA模型判別統(tǒng)計結(jié)果?？傮w而言，在對受單一霉菌感染大米樣品的霉變狀態(tài)進(jìn)行快速識別時，近紅外、中紅外和電子鼻技術(shù)均取得了較高的精度。建模集的正確率均達(dá)到100%，預(yù)測集中，僅個別樣品出現(xiàn)誤判，表明基于光譜和氣味信息進(jìn)行霉變狀態(tài)快速分析具有可行性。對受4種霉菌感染的大米霉變狀態(tài)進(jìn)行分析時，由于不同霉菌之間產(chǎn)生的相互干擾，模型性能有所下降。預(yù)測集中，在近紅外光譜所建模型中，40個樣品有8個被誤判，導(dǎo)致其正確率僅為80.0%。由于中紅外光譜法能獲得樣品間的細(xì)微信息，其模型性能有所提升，達(dá)87.5%。相反，基于氣味信息的電子鼻分析技術(shù)取得了較優(yōu)的分析精度。在不同霉菌感染所產(chǎn)生的氣味干擾中，對大米霉變程度獲得了95.0%的預(yù)測精度，表明電子鼻在大米霉變程度的快速識別中可能更加可靠。

表2 接種不同有害霉菌的樣品在不同儲藏時間DA模型的建立與驗證結(jié)果

3 結(jié)論

本研究利用近紅外、中紅外和電子鼻無損分析技術(shù)，對受不同霉菌感染的大米樣品在儲藏期內(nèi)的光譜和氣味信息進(jìn)行了檢測分析，并結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法建立了大米有害霉菌侵染種類與霉變程度的同步識別方法。主成分分析結(jié)果顯示在儲藏期間大米樣品的光譜和氣味信息變化存在一定規(guī)律，不同霉變狀態(tài)樣品能夠得到區(qū)分。運(yùn)用線性判別分析分別對侵染單一霉菌的大米樣品及全部樣品進(jìn)行建模。其中，電子鼻技術(shù)對大米受不同霉菌感染及霉變狀態(tài)的識別率分別達(dá)到92.0%和95.0%，近紅外光譜為86.0%和80.0%，中紅外光譜為86.0%和87.5%，表明利用光譜和氣味信息實現(xiàn)大米霉變的快速早期識別具有可行性，電子鼻技術(shù)在霉變大米氣味特征識別方面更具優(yōu)勢，有實際應(yīng)用潛力。

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