基于掃描電鏡觀察研究真菌孢子檢測對稻谷霉變判定

唐 芳 歐陽毅 祁智慧

(國家糧食局科學研究院，北京 100037)

稻谷是我國主要口糧，作為戰(zhàn)略儲備糧之一，部分稻谷儲存時間超過一年，因此稻谷儲藏安全是關(guān)系到百姓健康、關(guān)乎國計民生的大事。近年來，部分稻米加工和儲藏企業(yè)為了提高經(jīng)濟效益，盡可能提高稻谷儲藏水分，以提高整精米率。而高水分稻谷儲運過程中，很容易為微生物滋生提供條件。稻谷的儲藏安全問題不容忽視。稻谷儲藏是否安全，首先要明確判定標準。針對糧食儲藏安全判定標準，國內(nèi)外開展了大量研究工作，總體可歸納為三大類[1]：CO2和干重損失、籽粒發(fā)芽能力、肉眼可見霉菌。依據(jù)C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O+heat公式，儲糧質(zhì)量變化與糧食自身以及生長的微生物呼吸代謝密切相關(guān)。Karunakaran等[2-4]通過測CO2釋放速率預測糧食質(zhì)量下降情況，由于檢測需要精密儀器，且受實際倉儲氣密性影響，CO2波動范圍較大，鮮見在實際倉儲中應用。Seib[5]等提出將干重損失作為糧食質(zhì)量變化一項指標，但干重損失多少時糧食質(zhì)量達到不可接受的程度，仍備受爭議[5-7]。發(fā)芽能力是種子具有生命力的典型特征，可作為糧食種子安全的判定標準[4,8-10]，它受溫度、水分、破碎以及蟲霉侵染等多方面因素的影響，很容易導致下降，因此，作為口糧或儲備糧質(zhì)量安全的判定標準過于嚴格。肉眼可見霉菌是應用較為廣泛的判定標準，因其操作簡單直觀，有些學者認為是最佳的判定標準[11-13]，同時也有部分學者提出這個標準仍存在缺點[14-15]：一方面，肉眼觀察到糧粒上有霉變時，糧食質(zhì)量已經(jīng)出現(xiàn)問題，缺乏預測性，另一方面，觀察者主觀性很強，判別差異性很大。因此，肉眼可見霉菌作為安全的判定標準也一直備受爭議。Magan曾提出[15]，顯微鏡下觀察到微生物菌絲及孢子生長更為及時準確。筆者認為，為確保糧食食用安全，不發(fā)生霉變是最基本判定依據(jù)。筆者在前人研究的基礎上，經(jīng)過多年的研究，建立儲糧霉菌檢測方法——真菌孢子計數(shù)法[16]。本實驗以實倉儲藏稻谷樣品為研究對象，基于掃描電鏡觀察稻谷籽粒不同加工階段微生物生長情況，并與原糧真菌孢子計數(shù)檢出水平進行對比，以確定稻谷霉變檢測判定界限，用于指導儲運過程中稻谷霉變判定，為稻谷儲藏安全提供檢測和判定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

東北粳稻，采自北京某糧食收儲庫，2016年4月入庫，9月29日糧堆表層共選取12個點，每點在距離表面40 cm出手動采樣，取樣量500 g左右，樣品于4 ℃低溫保存。

1.2 主要儀器

SMART生物顯微鏡：重慶奧特公司；M205FA體視顯微鏡：德國徠卡公司；E1010離子濺射儀：日本日立公司；S-3000N掃描電子顯微鏡：日本日立公司；JDMZ 100稻谷出米率檢測儀：北京東方孚德公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 真菌孢子計數(shù)法[16]

1.3.2 稻谷脫殼碾米處理

從備選樣品中稱取一定量稻谷籽粒，一部分采用手工脫殼，一部分采用礱谷脫殼，脫殼后糙米裝入密封袋內(nèi)標注備用。取一定量礱谷脫殼糙米進行碾米加工，制備一級大米[17]，并分裝入密封袋內(nèi)標注備用。

1.3.3 體視顯微鏡觀察

稱取一定量實驗稻谷原糧籽粒及糙米樣品，用體視顯微鏡放大8倍左右進行觀察。

1.3.4 掃描電鏡觀察

對稻谷原糧籽粒、處理后糙米以及一級大米，按照組別隨機選取三粒，將試驗樣品有序粘在掃描電鏡樣品盤上，采用離子濺射儀對樣品表層進行噴金處理，并對籽粒胚乳和胚部進行掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

大部分真菌具有好氧生長特性，糧食儲存期間，適宜條件下，真菌先在糧粒表面開始生長。針對這一特性，筆者開發(fā)了儲糧真菌快速檢測方法—真菌孢子計數(shù)法：一定量的糧食樣品，通過加水劇烈振蕩，洗脫糧粒表面已生長的真菌孢子，洗脫液過濾后，于顯微鏡下放大600～800倍進行真菌孢子觀察計數(shù)。采用該方法對不同感染水平的小麥、稻谷樣品進行了重復性實驗(n=8)，相對標準偏差(RSD%)范圍在8.2%～31.4%；與平板菌落計數(shù)法比較，相關(guān)系數(shù)r2=0.847 9，表明兩種方法具有良好的相關(guān)性[16]。方法操作簡單，單個樣品檢測時間2-3 min。方法特點是在傳統(tǒng)細胞計數(shù)法基礎上，通過對真菌孢子檢測濃度設限(1.0×105個/g)，消除了樣品自身攜帶真菌孢子的干擾，達到僅檢測儲藏過程中生長真菌的目的。

本研究采用上述真菌孢子檢測方法，對糧庫采集的樣品進行孢子計數(shù)，選取孢子檢出水平范圍分別在0～5.0×104、1.0～5.0×105、1.0～5.0×106個/g的樣品，標記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 組。對各組樣品進行表觀色澤氣味觀察比較，并對各組樣品原糧、糙米、一級大米進行顯微特征觀察。具體研究結(jié)果如下。

2.1 表觀色澤氣味比較

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組樣品并排擺放，肉眼觀察，顏色略有差別，但不明顯。每個樣品肉眼觀察時，未見明顯霉變籽粒。不同組別的稻谷樣品，剛開啟密封袋時，氣味略顯差異，Ⅰ組樣品略帶稻谷固有香氣，Ⅱ組樣品無香氣也無異味，Ⅲ組樣品略帶霉味。密封袋開封后敞開放置一段時間，氣味沒有差異。

2.2 體視顯微鏡觀察結(jié)果

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組樣品，每組樣品中隨機稱取20 g原糧籽粒放于玻璃皿中待觀察。每組樣品各稱取100 g樣品進行礱谷脫殼，然后稱取20 g糙米籽粒放于玻璃皿中待觀察。按方法1.3.3分別觀察原糧籽粒和糙米籽粒，觀察結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組稻谷表面體視顯微鏡圖片(8×)

圖2 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組糙米表面體視顯微鏡圖片(8×)

從圖1、圖2可以看出，Ⅰ組稻谷穎殼顏色鮮亮，Ⅱ組少數(shù)籽粒穎殼有銹斑，顏色略暗，Ⅲ組部分籽粒穎殼有銹斑，顏色變暗。銹斑在8倍放大的情況下，不能確認為霉菌斑。對各組別糙米放大觀察，糙米色澤亮度未見明顯差異，三組糙米表面均未見明顯霉斑，未達到稻谷國標[18]中“生霉?！钡臉藴省暗竟攘Ｉ梗ず蟛诿妆砻嬗忻拱叩念w?！?。但仔細觀察，Ⅲ組糠皮層局部破壞區(qū)增加，胚芽部分不夠飽滿。

2.3 掃描電鏡觀察結(jié)果

2.3.1 稻殼表面

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組稻谷樣品中，隨機選擇稻谷籽粒，掃描電鏡放大500倍后，觀察稻殼表面情況。從圖3可以看出，不同組別稻殼表面菌絲和孢子分布密度存在明顯差異。Ⅰ組稻谷穎殼凸起光滑，表面難尋真菌孢子和菌絲蹤跡；Ⅱ組穎殼表面可見附著物，可觀察到真菌孢子與菌絲結(jié)構(gòu)；Ⅲ組穎殼表面附著物數(shù)量明顯增加，真菌孢子和菌絲明顯比Ⅱ組多。

圖3 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組稻殼表面電鏡掃描圖片(500×)

2.3.2 糙米表面

2.3.2.1 手剝脫殼糙米表面電鏡觀察

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組稻谷樣品，隨機稱取10 g樣品，逐一采用手剝脫殼，并置于玻璃皿中。每組糙米樣品隨機選取3粒，按1.3.4方法處理，并對籽粒胚乳和胚部進行掃描電鏡觀察。每組3粒樣品電鏡觀察后，選取共性較強具有代表性的圖片進行比較，觀察結(jié)果見圖4～圖7。

由圖4～圖7可以看出，Ⅰ組稻谷真菌孢子檢出水平為0～5.0×104個/g，糙米籽粒胚乳及胚部表面幾乎找不到真菌孢子與菌絲；Ⅱ組檢出水平為1.0～5.0×105個/g，可觀察到少量真菌孢子與菌絲；Ⅲ組檢出水平為1.0～5.0×106個/g，可觀察到大量真菌孢子與菌絲體，密度大，菌絲較Ⅱ組的粗壯，且分布較多分生孢子梗結(jié)構(gòu)。手剝脫殼情況下，對糙米糠皮層幾乎沒有損傷，外層果皮上生長的菌絲和孢子幾乎保留原有狀態(tài)。不同組別樣品糙米表面真菌孢子和菌絲分布密度與稻谷原糧真菌孢子檢出水平呈正相關(guān)。

圖4 Ⅰ組手剝脫殼糙米胚部表面(左100×、右500×)

圖5 Ⅱ組手剝脫殼糙米胚部表面(左100×、右500×)

圖6 Ⅲ組手剝脫殼糙米胚部表面(左100×、右500×)

圖7 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組手剝脫殼糙米胚乳表面(1 000×)

稻米雖有穎殼保護，當微生物生長到一定程度時，可通過縫隙或裂縫進入，進一步侵染糙米表面。微生物生長會分泌酶類,為其生長提供營養(yǎng)成分，進而導致裂縫擴大[19]。Ⅲ組糙米胚及胚乳表面存在大量的菌絲孢子，多個分生孢子梗結(jié)構(gòu)清晰可見，且胚部菌絲孢子量明顯大于胚乳，這與胚芽營養(yǎng)豐富有關(guān)。而這些糙米樣品，肉眼觀察時無明顯差別。

2.3.2.2 礱谷機械脫殼糙米表面電鏡觀察

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組稻谷樣品，隨機稱取30 g樣品，礱谷脫殼后得到糙米，并分別置于玻璃皿中。后續(xù)處理方法同手剝脫殼糙米樣品，觀察結(jié)果見圖8～圖11。

圖8 Ⅰ組礱谷脫殼糙米胚乳表面(左40×，右1 000×)

圖9 Ⅱ組礱谷脫殼糙米胚乳表面(左40×、右1 000×)

圖10 Ⅲ組礱谷脫殼糙米胚乳表面(左40×、右1 000×)

圖11 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組礱谷脫殼糙米胚部 (1 000×)

由組圖8～圖11可以看出，礱谷脫殼過程中，由于膠輥的擠壓和撕搓，致使穎殼脫離，對大面積鼓起的胚乳部分有一定的損傷。I組表面干凈，Ⅱ組表面可觀察到菌絲附著，有個別散落的孢子，Ⅲ組仍可觀察到大量散落的孢子以及被撕扯過菌絲。處于端側(cè)的胚部是內(nèi)陷結(jié)構(gòu)，損傷較小，與手動剝殼比較，Ⅱ、Ⅲ組糙米胚部仍可清晰觀察到菌絲孢子結(jié)構(gòu)，但由于機械摩擦振動或風力作用，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及部分孢子會脫落，孢子數(shù)量相應減少。由此可見，由于礱谷脫殼對糙米表面會造成一定程度的機械損傷，破壞糠皮層的完整結(jié)構(gòu)。若稻谷原糧已有一定程度真菌生長，糙米表面損傷將為真菌入侵籽粒內(nèi)部提供有利條件，造成潛在的安全隱患。

2.3.3 一級大米表面電鏡觀察

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組稻谷樣品，隨機稱取100 g樣品，按大米國標[17]要求礱碾至一級大米，并置于玻璃皿中。后續(xù)處理方法同手剝脫殼糙米樣品，觀察結(jié)果見圖12、圖13。

圖12 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組一級大米胚乳部位表面

圖13 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組一級大米胚部表面(1 000×)

圖12為一級大米胚乳表面，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組一級大米粒表面幾乎沒有皮層殘留痕跡，亞糊粉層直接暴露。粒面基本觀察不到完整的孢子菌絲結(jié)構(gòu)。亞糊粉層隨著真菌檢出水平的增加，表面呈現(xiàn)逐漸平滑趨勢。圖13為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組樣品米胚去凈后，胚部淀粉質(zhì)細胞直接暴露，細胞壁清晰可見。細胞內(nèi)淀粉顆粒粒徑存在明顯差異，隨原糧真菌孢子檢出水平升高，粒徑逐步變小。胚芽營養(yǎng)豐富，為微生物生長提供了充足的養(yǎng)分，而胚部真菌大量生長繁殖，已經(jīng)穿透胚芽，影響到胚部細胞層。因此，導致真菌分布密度越大，胚部細胞淀粉顆粒粒徑越小，兩者呈負相關(guān)。

由此可見，糙米經(jīng)過碾磨處理后，大部分表層的菌絲孢子可被清除，但大米亞糊粉層及胚部細胞發(fā)生的變化，仍與微生物生長程度密切相關(guān)。化學成分是否有變化或微生物代謝產(chǎn)物是否有積累，仍需進一步研究。

3 結(jié)論

3.1 稻谷雖有穎殼保護，霉菌菌絲仍能通過縫隙或裂縫進入，在糙米表面生長繁殖，且胚芽部位因營養(yǎng)豐富，霉菌生長量大于胚乳部分。

3.2 糙米表面攜帶的真菌孢子菌絲量與原糧表面真菌孢子檢出水平呈正相關(guān)。通過掃描電鏡觀察研究，初步確定真菌孢子檢出在1.0～5.0×105個/g水平時，稻谷籽?？膳卸殚_始霉變，1.0～5.0×106個/g水平時，稻谷籽?？膳卸閲乐孛棺儭?/p>

3.3 原糧真菌孢子檢出水平在1.0～106個/g以上，機械脫殼的糙米，糠皮層遭到破壞，表面損傷為真菌入侵籽粒內(nèi)部提供有利條件，糙米儲存存在較大安全隱患。經(jīng)碾磨后得到一級大米，胚乳亞糊粉層以及胚部淀粉顆粒均發(fā)生一定程度的變化，是否存在食用安全隱患，有待于進一步研究。

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