弓形蟲病診斷方法研究進展

張義偉，鮑 麗，張 婷，李 嬌，段 萍，馮 穎，陳啟軍，姜 寧

（1. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110866；2. 遼寧省血液中心，遼寧沈陽 110000）

弓形蟲是頂器復(fù)合門原蟲，屬于孢子蟲綱真球蟲目，是一種常見的寄生蟲，引起的弓形蟲病是危害人畜健康和經(jīng)濟發(fā)展的人獸共患病之一。免疫力正常的宿主感染弓形蟲后，常處于無癥狀帶蟲狀態(tài)，不易被發(fā)現(xiàn)，只有檢出病原體或血清抗體時才可確診[1]。臨床上一些非典型表現(xiàn)，以及其與邊界病的相似之處，會導(dǎo)致誤診和不恰當(dāng)治療。弓形蟲可引起綿羊和山羊流產(chǎn)或產(chǎn)弱羔及木乃伊胎，臨床癥狀與邊界病或羊衣原體病有很多類似之處。牛患弓形蟲病雖然少見，但我國、德國、加拿大和新西蘭等多個國家簽署的有關(guān)進口牛衛(wèi)生條款中，也將其列為須規(guī)定檢疫的疫病[2]。豬感染弓形蟲后會出現(xiàn)高熱，呼吸及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，懷孕母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死胎，甚至死亡。因此，在牛、羊和豬等牲畜的檢疫工作中，準(zhǔn)確檢疫和科學(xué)處理可大大減少，因弓形蟲導(dǎo)致經(jīng)濟損失。

從血液或體液中分離弓形蟲，在組織中檢測寄生蟲，或通過DNA探針檢測特定的核酸，并通過血清學(xué)檢測由宿主合成的弓形蟲特異性免疫球蛋白等，均可作為弓形蟲的檢測方法[3]。國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布的檢驗方法主要有間接血凝 試 驗（Indirect hem agglutination test，IHA）、酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、間接免疫熒光測定（Indirect immuno fluorescence assay，IFA）、免疫酶試驗法（Immunoenzymatic assay ，IEA）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）。這些檢測方法各有優(yōu)劣?？焖僭\斷與鑒定弓形蟲，是防控該病的良好手段，所以找到簡單、有效、快速、準(zhǔn)確的弓形蟲病診斷方法尤為重要。

1 染色試驗（Sabin-feldman dye test，DT）

DT于1948年首次應(yīng)用，曾被視為檢測人類弓形蟲抗體的金標(biāo)準(zhǔn)，是弓形蟲病病原特有的血清學(xué)檢測方法和最有價值的檢測手段，具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性。但若選用體外培養(yǎng)的速殖子，由于毒力較弱，也可能出現(xiàn)假陰性。因此，進行檢查時必須使用活的、有毒力的速殖子，但由于存在危險性，DT法未能得到廣泛引用。Udonsom等[4]收集了210份人血清樣本并用常規(guī)DT試驗和間接免疫熒光抗體染色試驗（Indirect fluorescent antibody test，IFAT）進行對比，發(fā)現(xiàn)利用從小鼠體內(nèi)獲得的速殖子，應(yīng)用傳統(tǒng)DT試驗檢測的檢出率為4.3%，IFAT檢出率為3.8%。而利用從體外培養(yǎng)的速殖子檢測顯示，DT和IFAT方法的檢出率均為2.8%。2005年，Oncel等[5]使用DT和乳膠凝集試驗（LAT）對從亞洛瓦2個地區(qū)的63只大于1歲的綿羊收集的血清進行了抗弓形蟲抗體測試，在所測試的63個樣品中，分別有42個（66.66%）和41個（65.08%）通過DT和LAT法確定為血清反應(yīng)陽性。試驗中DT為主要參考方法。所以，即使檢測方法逐年增多，DT法仍然是檢測弓形蟲病的有效手段。

2 間接血凝試驗（IHA）

IHA的主要原理是對紅細胞致敏的弓形蟲可溶性抗原可由陽性血清凝集，可形成抗原-抗體復(fù)合物，具有微量、快速、敏感等優(yōu)點。然而一些急性和先天性感染可能不被檢出，且由于可以和血吸蟲病患者血清產(chǎn)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致檢測結(jié)果特異性不高。但由于有簡便快速的特點，IHA常被應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查中[6]。Luo等[7]也利用商業(yè)化IHA試劑盒對江西省動物園中的野生動物和13個縣的動物進行了弓形蟲抗體測定，同時利用該法對我國湖北省4個森林和鄉(xiāng)村地區(qū)進行了弓形蟲流行病學(xué)調(diào)查[8]。應(yīng)用這一檢測方法，可以更方便研究者進行流行病學(xué)調(diào)查，從而有助于規(guī)劃我國各地區(qū)對動物弓形蟲感染的預(yù)防。

3 改良凝集試驗（Mend agglutination test，MAT）

MAT法由Dubey[9]建立，被認(rèn)為是特異敏感的檢測方法，所用材料主要是由福爾馬林固定的弓形蟲速殖子和U型微孔板。MAT還可以用于感染早期抗體的檢測。2017年，F(xiàn)ortes等[10]用MAT法調(diào)查了巴西南部94個羊群中1 058只山羊的弓形蟲感染情況，并與IFAT法和ELISA法進行了比較。結(jié)果顯示：IFAT、ELISA和MAT的檢出陽性率分別為30.0%、33.3%和25.3%。通過統(tǒng)計學(xué)分析，3種檢測方法結(jié)果相關(guān)，沒有顯著差異。而MAT的結(jié)果不同，取決于制備抗原的保存劑。以丙酮代替福爾馬林可檢測急性感染中的IgG抗體。這對獲得性免疫缺陷綜合征患者和急性腺性弓形蟲病診斷有重要意義[11]。此外，MAT還可用于檢測屠宰綿羊體液中的弓形蟲感染，其靈敏度高于其他血清學(xué)試驗[12]。該方法簡便、準(zhǔn)確，便于實驗室診斷和流行病學(xué)調(diào)查，是目前公認(rèn)的弓形蟲檢測金標(biāo)準(zhǔn)。

4 間接免疫熒光抗體染色試驗（IFAT）

IFAT是一種簡單的人或動物體內(nèi)弓形蟲IgM和IgG抗體檢測方法[13]。該方法先將弓形蟲速殖子與待測血清孵育，之后加入熒光素標(biāo)記的抗體，結(jié)果在熒光顯微鏡下觀測。Dos等[14]和Shaapan等[15]利用該方法檢測，發(fā)現(xiàn)出敏感性為80.4%～100.0%，特異性為91.4%～95.8%。然而，在這一方法的應(yīng)用中，熒光顯微鏡是必須設(shè)備，對結(jié)果需要人眼主觀判斷，很有可能產(chǎn)生主觀差異。而且，該方法會與類風(fēng)濕因子等發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性差[16]。

5 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA是用于檢測不同動物血清和肉汁中弓形蟲抗體的血清學(xué)試驗，可以在短時間內(nèi)進行大量檢測。ELISA系統(tǒng)通常包括固相抗原或抗體、酶標(biāo)記抗原或抗體，以及酶反應(yīng)的底物，可以進行抗體和抗原修飾。目前，已經(jīng)有多種類型的ELISA方法可用于檢測弓形蟲抗體或抗原，如間接ELISA、夾心ELISA和親和力ELISA法等。

5.1 間接ELISA

在間接ELISA中，先把抗原涂覆到固相上，之后加入含有抗體的樣本，再添加一種級聯(lián)的酶抗體來增強抗原抗體反應(yīng)，通過生成顏色來量化評價酶的反應(yīng)（圖1）。幾乎所有測試都可用于檢測抗弓形蟲IgG、IgM和IgA抗體[17]。在常規(guī)間接ELISA方法中，利用速殖子抗原（Tachyzoite lysate antigen，TLA）作為包被抗原，在檢測人和動物抗弓形蟲IgG和IgM抗體時，與其他檢測方法（如DT、MAT和IFAT）有高度一致性。盡管這一結(jié)果令人滿意，但在不同實驗室和不同產(chǎn)品批次間，檢測結(jié)果仍然存在差異，且難以評估，因此使用另一種重組蛋白方法，它具有抗原精確、易于標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)點。在過去的20多年里，許多的重組抗原，包括致密顆?？乖璆RA1、GRA2、GRA4、GRA6、GRA7、和GRA8，棒狀體蛋白ROP1和ROP2，基質(zhì)蛋白MAG1，微線體蛋白MIC2、MIC3、MIC4、和MIC5，表面抗原SAG1和SAG2等，均已在大腸桿菌和酵母中表達，對于人類或動物ELISA檢測具有潛在診斷價值。重組蛋白抗原組合使用較單一抗原，因而檢測結(jié)果的特異性和敏感性更強，如SAG2A、GRA2、GRA4、ROP2、GRA8和GRA7的組合，很有可能用于人類和動物感染早期IgG 抗體的檢測[18]，ROP1、SAG1、GRA7、GRA8和GRA6則很有可能用于特異性IgM抗體的檢測[19]，然而 GRA7和GRA8一般是用來檢測特異性IgA抗體的。

圖1 間接ELISA系統(tǒng)模式

5.2 夾心ELISA

在夾心ELISA中，先把抗原或抗體包被在固相上，再把抗體或抗原加入反應(yīng)體系，進行孵育和洗滌后，抗原抗體復(fù)合物就會固定在固相上。被捕獲的抗體或抗原通過添加酶標(biāo)記的特異性抗原或抗體來檢測。在人類IgM抗體檢測時，這種方法比IFAT的特異性和敏感性更強[17]。另一種從兩種物種中制備的抗MIC10抗體夾心ELISA法，可以用于檢測循環(huán)抗原MIC10，用弓形蟲病的早期診斷[20]（圖2）。

圖2 夾心ELISA系統(tǒng)模式

5.3 親和力ELISA

親和力ELISA定量試驗法早期主要用于風(fēng)濕病毒感染檢測，可以區(qū)分風(fēng)濕病毒的初次感染和以往感染。2001年，Villavedra等利用改進的親和力ELISA法和聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-page），結(jié)合電洗脫，分離了30～33 KDa的抗原決定簇（根據(jù)N端序列數(shù)據(jù)得出該抗原主要由SAG1和植物幾丁質(zhì)等具有高度同源性的蛋白組成），與全抗原IgG親和力指數(shù)相比，該抗原更能區(qū)分弓形蟲的急性和慢性感染。Sager等[21]使用親和純化的天然剛地弓形蟲P30抗原進行IgG的親和力試驗，顯示抗體可使抗原的功能性親和力上升，因而可以確定綿羊急性和慢性弓形蟲感染。P30抗原可以從市面上直接購得，省時省力，在弓形蟲急慢性感染鑒定中有較高的應(yīng)用價值。

6 免疫膠體金技術(shù)（Immune colloidal gold technique，GICT）

GICT是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，應(yīng)用于抗原抗體的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。20世紀(jì)70年代[22]，免疫化學(xué)領(lǐng)域膠體金的引入，為研制特異、敏感、快速、便捷的免疫學(xué)檢測技術(shù)和臨床診斷方法奠定了基礎(chǔ)。在檢測弓形蟲陽性血清時，山羊弓形蟲病免疫膠體金快速檢測試紙條血清稀釋倍數(shù)可達到1∶5 120，且制備的試紙條與山羊球蟲陽性血清、山羊布氏桿菌和日本血吸蟲陽性血清均無交叉反應(yīng)。王艷華等[23]利用自主研制的弓形蟲免疫膠體金快速檢測試紙條，對豬弓形蟲陽性血清、豬瘟陽性血清、豬傳染性胸膜炎陽性血清和豬衣原體陽性血清進行檢測，發(fā)現(xiàn)豬弓形蟲病血清與其他血清均無交叉反應(yīng)，特異性好。且該試紙條在兔子感染后第3天即可檢測到抗體，比間接血凝試驗（5天）更快，說明該試紙條的靈敏性更高。免疫膠體金快速檢測試紙條具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，可用于弓形蟲病的早期檢測和診斷，適合在基層推廣應(yīng)用。

7 干擾素釋放反應(yīng)（Interferon-gamma release assay，IGRA）

IGRA主要應(yīng)用于弓形蟲感染早期，是檢測細胞介導(dǎo)的一種抗弓形蟲免疫體外診斷手段，操作簡易，成本較低。在我國，IGRA主要應(yīng)用于牛結(jié)核病檢測[24]。在弓形蟲檢測方面，目前主要應(yīng)用于人。在弓形蟲感染階段，機體有很強的Th1型反應(yīng)[25-26]。這一免疫應(yīng)答反應(yīng)的特征是寄生蟲會誘導(dǎo)產(chǎn)生大量IL-12和IFN-γ。IGRA可以準(zhǔn)確地將感染患者與未感染患者區(qū)分，而且即使由弓形蟲抗原刺激全血標(biāo)本僅1天，也會有很強的淋巴細胞活化反應(yīng)[27]。Chapey等[28]研究發(fā)現(xiàn)弓形蟲感染患者的IFN-γ分泌明顯高于未感染者。Fatoohi等[29]研究發(fā)現(xiàn)，將弓形蟲感染患者的細胞暴露在有弓形蟲可溶性抗原的條件下，會產(chǎn)生大量的IFN-γ，而在女性陰性細胞中不存在IFN-γ分泌上調(diào)現(xiàn)象。Cristina等[30]研究發(fā)現(xiàn)，與陰性對照相比，從弓形蟲血清陽性患者中獲得的外周血單個核細胞，在用GST-BAG1重組蛋白質(zhì)刺激后，IFN-γ的分泌水平會增加8～20倍。在先天性弓形蟲病診斷中，Emmanuelle等[28]對在懷孕期間感染患者所生的1歲以下嬰兒進行檢測，發(fā)現(xiàn)檢查結(jié)果的敏感性和特異性分別為94%和98%。IGRA的發(fā)展是弓形蟲早期診斷的一項重要進步，強調(diào)了評估細胞免疫的重要性，有利于先天性弓形蟲病的早期診斷。因此，IGRA將會成為一種潛在有效的人和動物弓形蟲感染的早期檢測工具。

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