2016—2017年廣西4種野生鳥類新城疫病原學(xué)檢測與遺傳進(jìn)化分析

謝麗基，謝芝勛，羅思思，鄧顯文，謝志勤，王 盛，黃嬌玲，曾婷婷，張艷芳，范 晴，張民秀

（廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西南寧 530001）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的，以感染禽類為主的一種急性、烈性傳染病[1]。盡管NDV只有1個血清型，但不同毒株間的生物學(xué)特性存在明顯差異。根據(jù)NDV F基因高變區(qū)序列差異，可將毒株分為兩類：Ⅰ類（ClassⅠ）和Ⅱ類（ClassⅡ）[2-3]。Ⅱ類NDV流行時間較長，至少包括18個基因型。導(dǎo)致世界各國ND大流行的強(qiáng)毒株和常用弱毒疫苗株均屬于此分支[4-5]。

與Ⅱ類相比，Ⅰ類NDV出現(xiàn)較晚。我國2008年后陸續(xù)檢測和分離到了Ⅰ類 NDV[6-7]。雖然研究表明所有Ⅰ類NDV均為無毒或弱毒株，但已有學(xué)者證實Ⅰ類NDV可通過在雞或雞胚中連續(xù)傳代增強(qiáng)毒力[8-9]。野鳥是NDV的自然儲存宿主，可作為病毒的傳播媒介，隨自然遷徙將病毒傳染給家禽，導(dǎo)致家禽ND的暴發(fā)[10]。新疆、吉林、湖南和陜西等地對野生鳥類進(jìn)行了ND監(jiān)測，探索了野生鳥類與家禽NDV感染的區(qū)別和聯(lián)系，通過分析NDV遺傳進(jìn)化情況，預(yù)測了家禽NDV感染的流行趨勢，為ND防治提供了理論依據(jù)[10-15]。

廣西是鳥類的主要遷徙地，同時擁有龐大的野生鳥類資源[16]，因此有必要對廣西野鳥攜帶的Ⅰ類和Ⅱ類NDV都進(jìn)行監(jiān)測。本研究于2016—2017年在廣西采集4種野生鳥類的口咽/泄殖腔棉拭子樣本進(jìn)行病毒分離鑒定，并對分離毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，從而為科學(xué)防控ND提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

病毒基因組RNA/DNA快速純化試劑盒和DNA片斷膠回收試劑盒：購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Prime Script II 1stStrand cDNA Synthesis Kit、Premix Ex TaqTM試劑盒和PMD18-T試劑盒：購自大連寶生物公司。

1.2 樣品和SPF雞胚

樣品：采自2016—2017年廣西野生動物救護(hù)中心收容和救護(hù)的4種野鳥；SPF雞胚：購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司，由本實驗室無菌孵化至9～11日齡。

1.3 病毒分離鑒定

將采集的咽喉/泄殖腔棉拭子，放入青-鏈霉素PBS溶液中，低溫（4 ℃）作用4 h，然后充分捻轉(zhuǎn)、擠壓，3 000 r/min離心10 min；取上清接種9～11日齡SPF雞胚，收獲24～96 h內(nèi)死亡或活胚的雞胚尿囊液，通過血凝試驗（HA）、血凝抑制（HI）試驗進(jìn)行病毒鑒定。

1.4 核酸提取

參照RNA/DNA快速純化試劑盒說明書，對HA和HI鑒定為NDV陽性的尿囊液提取RNA。

1.5 RT-PCR擴(kuò)增

參照PrimeScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit說明書，對提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用國標(biāo) GBT 16550—2008和文獻(xiàn)[2，17]中的引物（表1），對NDV F基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。國標(biāo)GB/T 16550—2008中的引物未說明擴(kuò)增Ⅰ類，還是Ⅱ類NDV，文獻(xiàn)[2]中的引物說明特異擴(kuò)增Ⅰ類NDV，文獻(xiàn)[17]中的引物說明可擴(kuò)增Ⅰ類和Ⅱ類NDV。將50 μL PCR產(chǎn)物電泳后，切膠經(jīng)DNA片斷膠回收試劑盒純化回收。將純化PCR產(chǎn)物克隆至pMD-18T載體。陽性克隆送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

表1 試驗所使用引物序列

1.6 分離株F基因序列和遺傳進(jìn)化分析

根據(jù)測序結(jié)果，推導(dǎo)出NDV分離株F基因的氨基酸序列，確定112～117位氨基酸裂解位點基序。從GenBank數(shù)據(jù)庫下載NDV參考序列（表2），利用 MEGA 6軟件，對F基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，采用鄰位相連法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 病原學(xué)檢測

2016—2017年在廣西4種野鳥中開展了ND病原學(xué)檢測，共采集野鳥口咽/泄殖腔棉拭子650份，其中斑鳩120份、鷓鴣261份、鴿子215份、山雞54份。經(jīng)病毒分離、RT-PCR和序列測定，共分離到10株NDV，病毒分離率為1.54%。10株病毒中，5株來源于斑鳩，3株來源于鴿子，2株來源于鷓鴣（表3）。

表2 NDVF 基因序列分析參考毒株及其F 蛋白裂解位點詳細(xì)信息

表3 廣西地區(qū)4種野鳥新城疫病原學(xué)檢測

2.2 分離株F基因PCR擴(kuò)增

使用國標(biāo)GBT 16550—2008中的引物 P1和P2，運用RT-PCR對10 株NDV分離株進(jìn)行F 基因擴(kuò)增，僅分離到2株鷓鴣源NDV（“159 鷓鴣19”“158鷓鴣18”）中擴(kuò)增出535 bp的條帶。用文獻(xiàn)[2]中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果均為陰性。對另外8株NDV分離株，使用文獻(xiàn)[17]中的引物FTY1和FTY2，擴(kuò)增出 968 bp的條帶。10個NDV分離株F基因的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果見圖1。

圖1 NDV 廣西分離株F基因擴(kuò)增結(jié)果

2.3 分離株F基因序列和遺傳進(jìn)化分析

10株NDV分離株的氨基酸裂解位點基序均為112R-R-Q-K-R-F117，符合NDV強(qiáng)毒株的典型特征。對2016—2017年主動監(jiān)測中分離到的NDV進(jìn)行F基因序列測定，構(gòu)建了系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹（圖2）。所分離的10株NDV毒株中，8株為Ⅱ類NDV基因VI型（斑鳩源5株、鴿子源3株），2株為Ⅱ類NDV基因XII 型（均從鷓鴣中分離到）。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹所用序列為NDV F基因編碼區(qū)1～374位核苷酸（圖2）。

圖2 根據(jù)F基因1～374 bp核苷酸序列繪制的遺傳進(jìn)化樹

3 討論

據(jù)報道，我國新疆、吉林、湖南和陜西等地從野鳥中分離的NDV主要為Ⅱ類NDV的基因I、II和VI型[10-15]。與這些報道類似，本研究也發(fā)現(xiàn)了Ⅱ類NDV基因VI型。近年來，我國在家禽中檢測到了Ⅱ類NDV基因XII型[6，18]，但未在野鳥中發(fā)現(xiàn)。本研究在廣西鷓鴣中分離到了基因XII型，因此應(yīng)關(guān)注這種新型NDV在國內(nèi)野鳥和家禽中的分布和流行情況，加大主動監(jiān)測力度。由于當(dāng)前使用的NDV疫苗主要為基因VII、II和I型，鑒于基因XII型的發(fā)現(xiàn)，有必要開展當(dāng)前疫苗對XII型的免疫效果評估。同時，由于本研究樣品均采自廣西野生動物救護(hù)中心收容和救護(hù)的野鳥，來源相對單一，為更好地闡明4種鳥類NDV的病原生態(tài)學(xué)分布，后續(xù)應(yīng)拓寬鳥類樣品的采集范圍。

本研究中分離到NDV的野鳥狀態(tài)良好，無發(fā)病跡象，因而推測野鳥對基因VI和XII具有較好的適應(yīng)力與抵抗性，存在向周邊環(huán)境排毒的危險。廣西豐富的鳥類資源為NDV傳播創(chuàng)造了便利條件。

NDV 分離株F 蛋白裂解能力是判斷毒力的標(biāo)準(zhǔn)之一[19]。強(qiáng)毒株F蛋白裂解位點區(qū)的氨基酸組成是112R/K-R-Q-K/R-R-F117，而弱毒株相對應(yīng)的氨基酸組成是112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117[20-21]。本研究分離的10株NDV氨基酸裂解位點基序均為112R-R-Q-K-R-F117，符合NDV強(qiáng)毒株的典型特征。后續(xù)將會進(jìn)行分離毒株的MDT和ICPI致病指數(shù)測定以及全基因序列測定分析。

由于前期在對NDV F基因的PCR擴(kuò)增中，發(fā)現(xiàn)國標(biāo)中的引物P1和P2僅能擴(kuò)增Ⅱ類NDV的F基因；文獻(xiàn)[2]中注明的引物CI-F和CI-R并不能擴(kuò)增所有Ⅰ類NDV；文獻(xiàn)[17]中注明的引物FTY1和FTY2并不能擴(kuò)增所有Ⅰ類和Ⅱ類的NDV毒株。這可能是由于NDV F基因變異較大，特別是Ⅰ類和Ⅱ類NDV的F基因。因此，為避免漏檢，本研究使用了國標(biāo)、文獻(xiàn)[2]和文獻(xiàn)[17]中的3套引物同時進(jìn)行擴(kuò)增。此外，由于Ⅰ類NDV可通過在雞或雞胚中連續(xù)傳代增強(qiáng)毒力[8-9]，因此為更好地預(yù)測家禽NDV感染的流行趨勢，建議在國標(biāo)中增加Ⅰ類NDV的檢測引物。

4 結(jié)論

本研究于2016—2017年在廣西采集了4種野鳥的650份口咽/泄殖腔棉拭子進(jìn)行了NDV感染狀況調(diào)查和分子特征分析，共分離到10株病毒；10株分離毒株均為高致病性，其中8株為Ⅱ類NDV基因VI型，2株為基因XII 型。該結(jié)果表明我國野鳥中流行的NDV以基因VI型為主，但也出現(xiàn)了新基因型（基因XII型）。因此，應(yīng)加大對野鳥NDV監(jiān)測的力度，防止其將病毒傳染給家禽，同時開展當(dāng)前疫苗對對NDV XII型的免疫效果評估。

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