秋海棠中植物促生菌的篩選及其促生效果研究

鄧振山，段陽陽

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000)

植物促生菌(plant growth-promoting bacteria,PGPB)是指從植物根系表面或者植物體內(nèi)分離出來的、可促進(jìn)植物生長及其對(duì)礦物質(zhì)營養(yǎng)的吸收和利用，并能抑制有害生物的一類有益菌株。植物促生菌對(duì)植物的促生作用是通過多種機(jī)制和途徑實(shí)現(xiàn)的，主要包括：(1)產(chǎn)生調(diào)節(jié)植物生長的信號(hào)物質(zhì)，如吲哚乙酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素和乙烯；(2)非共生固氮；(3)抵抗病原菌；(4)溶解磷礦物及其他養(yǎng)分；(5)產(chǎn)生鐵載體；(6)產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸ACC脫氨酶[1]。此外，PGPB還能提高植物的抗逆性，如耐干旱、高鹽、重金屬毒害和農(nóng)藥，是防治植物病蟲害和誘導(dǎo)抗病性的天然菌源，具有較高的理論價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值[2-6]。同時(shí)，PGPB也可以應(yīng)用于微生物肥料的生產(chǎn)，是今后一段時(shí)期內(nèi)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)發(fā)展的重要領(lǐng)域和方向之一[7]。

秋海棠(BegoniagrandisDry)屬多年生草本植物，不僅是著名的觀賞花卉，還可藥用、食用，加工成飲料和飼料等[8]?，F(xiàn)有的研究主要集中在農(nóng)作物PGPB方面，而對(duì)花卉的PGPB研究較少。鑒于此，本研究以健康的秋海棠植株作為試驗(yàn)材料，從中分離出促生菌，通過解磷、固氮、產(chǎn)氨、產(chǎn)吲哚乙酸(indoleacetic acid，IAA)等生物學(xué)檢測，篩選出具有良好促生防病作用的菌株，同時(shí)進(jìn)行了盆栽試驗(yàn)和大田試驗(yàn)，以期為促生菌在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試植物種子及病原真菌 供試植物種子為大豆種子；供試指示病原真菌為番茄灰霉病菌(BotrytiscineraPers.)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.Niveum)、玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院鑒定并惠贈(zèng)。

1.1.2 盆栽試驗(yàn)基質(zhì) 盆栽試驗(yàn)所用培養(yǎng)基質(zhì)由珍珠巖和蛭石(質(zhì)量比1∶2)組成，滅菌分裝入一次性紙杯內(nèi)備用。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 (1)PDA培養(yǎng)基。馬鈴薯汁1 000 mL，葡萄糖(或蔗糖)20 g，瓊脂18 g，pH值自然，121 ℃下滅菌30 min。

(2)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g,瓊脂18 g,自來水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃下滅菌30 min。

(3)YMA培養(yǎng)基。甘露醇10 g，NaCl 0.1 g，酵母膏1.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCO33.0 g，瓊脂18 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃下滅菌30 min。

(4)無機(jī)磷培養(yǎng)基。葡萄糖10 g,(NH4)2SO40.5 g，KCl 0.3 g,MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，MnSO4·4H2O 0.02 g，Ca3(PO4)25 g，自來水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃下滅菌30 min。

(5)無氮培養(yǎng)基。K2HPO40.5 g,Ca(PO4)22.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,FeCl30.01 g,蒸餾水1 000 mL，pH 6.8～7.0，121 ℃下滅菌30 min。

(6)Kings B培養(yǎng)基。參考文獻(xiàn)[9]的方法配制。

(7)產(chǎn)IAA培養(yǎng)基。參考文獻(xiàn)[10]的方法配制。

1.2 方 法

1.2.1 樣品采集 將健康的秋海棠植株整株挖出，采集健康部位的根部和莖部，放入滅菌的采集袋，做好標(biāo)記并立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行促生菌的分離。

1.2.2 促生菌的分離與純化 在超凈工作臺(tái)上，將采集的秋海棠根部和莖部，分別用清水洗凈表面附著的雜質(zhì)后，進(jìn)行表面消毒(在體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液中浸泡1 min，用無菌水沖洗3次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%升汞溶液浸泡2～3 min，無菌水沖洗5次)[11]；用滅菌濾紙吸干多余水分后，再用無菌剪及滅菌刀將材料切割為6～8段(每段長度約0.5 cm)，將表面消毒的材料段分別置于3種篩選培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基、YMA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)中。將所有平板放置于(28±2) ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，反復(fù)純化直至獲得單一菌株，斜面保存并編號(hào)備用。為了驗(yàn)證材料表面消毒是否徹底，以經(jīng)表面消毒不做處理的材料在培養(yǎng)基上的組織印跡作為對(duì)照，檢驗(yàn)消毒效果。

1.2.3 抑菌活性的測定 采用平板對(duì)峙法進(jìn)行測定，以供試指示病原真菌為靶標(biāo)，將病原真菌接種于PDA平板進(jìn)行活化，于28 ℃下培養(yǎng)至病原菌長滿平板。用打孔器將活化后的病原真菌菌落打成直徑為4 mm的菌餅，置于PDA平板中央，用同樣的方法在距其2 cm處接種已經(jīng)分離純化的促生菌，每個(gè)平板接4個(gè)菌餅，以只接指示病原真菌的平板作為對(duì)照，每處理3次重復(fù)，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待對(duì)照平板上長滿菌絲時(shí)，采用十字交叉法測量對(duì)照組和處理組抑菌圈直徑，并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4 目標(biāo)菌株促生能力的測定 (1)解磷能力。將待測菌株接種在液體無機(jī)磷培養(yǎng)基上，在搖床上于250 r/min、(28±2) ℃培養(yǎng)72 h后，取上清液涂布在固體無機(jī)磷培養(yǎng)基上，依據(jù)溶磷圈直徑，初步確定該菌株的解磷能力[1]。

(2)固氮能力。將待測菌株接種在液體無氮培養(yǎng)基中，(28±2) ℃培養(yǎng)72 h后將菌懸液涂布在固體無氮培養(yǎng)基上，48 h后觀察生長情況，測定變色圈直徑。

(3)產(chǎn)IAA能力。 將待測菌株接種到Kings B培養(yǎng)基上，(28±2) ℃培養(yǎng)48 h后，每個(gè)平板滴加1 mL Salkowski試劑(每升10.8 mol/L H2SO4，含4.5 g FeCl3)，室溫暗處顯色2 h后，根據(jù)顯色深淺初步判斷產(chǎn)IAA含量。另取待測菌株接種于液體產(chǎn)IAA培養(yǎng)基中，于250 r/min、(28±2) ℃培養(yǎng)5 d，取2 mL培養(yǎng)液，10 000 r/min 離心15 min，每1 mL上清液中滴加0.5 mL Salkowski 試劑，室溫黑暗條件下顯色2 h 后，于530 nm處測定吸光度值(OD值)。以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，并以標(biāo)品IAA(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司生產(chǎn))對(duì)應(yīng)的OD值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IAA產(chǎn)量(mg/L)。

1.2.5 盆栽試驗(yàn) 選擇籽粒飽滿大豆種子浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的HgCl2溶液中5 min，無菌dH2O沖洗5次后并于室內(nèi)晾干[12-13]。大豆催芽2 d后，取長勢相同的豆芽植入紙杯中，每杯裝基質(zhì)70 g，每杯種植3株，并噴灑無菌水，各紙杯均放置于室外并在自然光照下培養(yǎng)，每天用無菌水噴灑1次。試驗(yàn)分別設(shè)接種單一促生菌株處理、接種菌株Y-01與Y-02混合菌液(兩種菌株經(jīng)培養(yǎng)后按照1∶1體積比混合而成)處理以及無菌水對(duì)照處理(CK)。取經(jīng)培養(yǎng)且OD600 nm=2.0的菌懸液(含菌量2×109mL-1)離心，將獲得的菌體細(xì)胞用生理鹽水洗滌3次后備用。待豆苗長出2片真葉后，取配制好的各處理菌液0.2 mL，稀釋至20 mL，進(jìn)行灌根處理，常規(guī)管理，處理30 d，測量各處理大豆植株的各種形態(tài)學(xué)參數(shù)(包括株高、根長、莖長、莖直徑、大豆果實(shí)鮮質(zhì)量)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.6 大田試驗(yàn) 大田試驗(yàn)分別設(shè)接種單一促生菌株處理、接種菌株Y-01與Y-02混合菌液(兩種菌株經(jīng)培養(yǎng)后按照1∶1體積比混合而成)處理以及無菌水對(duì)照處理(CK)，不同處理隨機(jī)排列，每處理3次重復(fù)，每小區(qū)20 m2，共栽培番茄160株。取經(jīng)培養(yǎng)且OD600 nm=2.0菌懸液(含菌量2×109mL-1)離心，將獲得的菌體細(xì)胞用生理鹽水洗滌3次，取配制好的各處理菌液1 mL，稀釋至100 mL，對(duì)長出2片真葉的番茄進(jìn)行灌根處理，CK用無菌水進(jìn)行根灌。分別于接種后15 d測量莖長、葉長、葉綠素含量以及60 d莖長、葉綠素含量、果實(shí)數(shù)量[14-16]，其中葉綠素含量用SPAD值表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel 2013進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋海棠促生菌菌株的篩選

用3種配方不同的培養(yǎng)基，從秋海棠根部和莖部共分離、純化出22株菌株，從中篩選出11株具有解磷、產(chǎn)IAA、固氮等促生特性或抑制病原菌生長能力較強(qiáng)的菌株，這些菌株的編號(hào)及相關(guān)信息如表1所示。由表1可見，11株菌株中，有10株具有產(chǎn)IAA能力，占分離總菌株數(shù)的45.45%；2株解磷菌株；3株具有固氮活性；5株具有抑制指示病原菌活性。其中菌株Y-01和P-10兼具解磷、產(chǎn)IAA性能，菌株N-02兼具固氮、產(chǎn)IAA性能。

2.2 秋海棠促生菌的抑菌能力

由2.1節(jié)可知,篩選獲得了5株具有抑制病原真菌能力的菌株，分別是P-03、P-06、P-09、P-15、P-16。采用平板對(duì)峙法測定以上5株促生菌體外抑菌情況，結(jié)果如表2所示。表2表明，這5株秋海棠促生菌對(duì)一種或多種指示菌具有抑菌活性，占分離菌株總數(shù)的45.5%。其中， P-16對(duì)4種供試病原真菌、P-15對(duì)3種供試病原真菌均表現(xiàn)出較廣的抑菌譜，且僅菌株P(guān)-16對(duì)西瓜枯萎病菌具有抑菌活性。菌株P(guān)-15和P-16對(duì)番茄灰霉病菌均具有抑菌活性，但抑菌能力差異不顯著。對(duì)玉米大斑病菌表現(xiàn)出抑菌活性的菌株分別是P-09、P-15和P-16，其中菌株P(guān)-15抑菌活性最高，抑菌圈直徑達(dá)(4.10±0.26) cm，三者間差異顯著。除菌株P(guān)-09外，其他測試菌株對(duì)棉花枯萎病菌均具有抑菌活性，其中P-06對(duì)棉花枯萎病菌的抑菌效果最強(qiáng)，其抑菌圈直徑可達(dá)(6.40±0.16) cm，顯著高于其他測試菌株。以上說明秋海棠促生菌中存在豐富的抗菌資源。

表1 11株秋海棠促生菌的主要特性Table 1 Characteristics of 11 growth promoting strains from Begonia grandis

表2 秋海棠促生菌的體外抑菌能力Table 2 Inhibitory activity of growth promoting strains in Begonia grandis cm

注：數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。ND表示未檢測到抑菌活性。同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Note:Data are mean±SE.ND indicates not determined.Different lowercase letters in same column indicate significant difference (P<0.05).The same below.

2.3 秋海棠促生菌的促生能力

11株菌株的促生能力測定結(jié)果(表3)表明，不同菌株的促生能力也有差異，其中Y-01的IAA產(chǎn)量最高，達(dá)到32.63 mg/L，這暗示Y-01的促生能力可能比較強(qiáng)。菌株間的拮抗預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，Y-01和Y-02之間的拮抗性很小，故將菌株Y-01和Y-02按照1∶1體積比混合組成混合菌，進(jìn)行盆栽和大田試驗(yàn)。

表3 11株秋海棠促生菌的體外促生能力Table 3 Plant growth promoting activities of 11 the growth promoting strains in Begonia grandis

注：“+”表示變色圈直徑≤5 mm，“++”表示變色圈或溶磷圈直徑為>5 mm～≤10 mm。

Note:+.Color halo diameter(d) was ≤5 mm;++.Color halo or P dissolve circle diameter was >5 mm-≤10 mm.

2.4 秋海棠促生菌的盆栽表現(xiàn)

大豆在室外培養(yǎng)30 d后的形態(tài)學(xué)參數(shù)見表4。表4表明，與CK相比，接種秋海棠促生菌對(duì)大豆植株具有一定促生作用。與CK相比，接種供試11株單一促生菌后，大豆株高均顯著增加，增幅為13.4%～39.3%，其中以接種菌株P(guān)-06增幅最大。與CK相比，11株單一促生菌中，除菌株P(guān)-15對(duì)根長無促生作用，P-03、P-10、P-16和Y-02對(duì)根長促生作用不顯著外，其他菌株促生作用顯著，其中菌株P(guān)-12根長增幅最大，為21.0%。與CK相比，接種11株單一促生菌后，大豆莖長均明顯增加，增幅為3.3%～39.5%，其中P-03增幅最大；除菌株P(guān)-01外，其他菌株均顯著高于CK。11株單一促生菌中，除了P-10、P-15、N-02、Y-01外，其他菌株對(duì)大豆莖直徑均無顯著促生作用。11株單一促生菌對(duì)大豆果實(shí)鮮質(zhì)量均有顯著促生作用?？傮w而言，接種11株單一促生菌后，大豆株高、根長、莖長、莖直徑和果實(shí)鮮質(zhì)量的平均值均較CK明顯增加，增幅分別為27.33%，15.84%，23.46%，13.20%和22.39%。接種Y-01+Y-02混合菌的促生效應(yīng)明顯優(yōu)于單一促生菌，大豆株高、根長、莖長、莖直徑、果實(shí)鮮質(zhì)量較CK分別增加37.42%，25.65%，38.53%，16.42%和34.84%。

表4 不同秋海棠促生菌對(duì)大豆生長的影響Table 4 Effects of different growth promoting strains of Begonia grandis on growth of soybean

2.5 秋海棠促生菌的大田表現(xiàn)

促生菌對(duì)大田番茄生長影響的結(jié)果見表5及表6。表5表明同，灌根15 d后，與CK相比，接種11株單一促生菌后，番茄的莖長、葉長和葉綠素含量(除菌株P(guān)-01外)均增加。其中接種菌株P(guān)-16的番茄莖長和葉長增幅最大，分別為18.1%和35.6%；接種菌株P(guān)-12，番茄葉綠素含量增幅最大，為35.1%。Y-01+Y-02混合菌液對(duì)番茄植株莖長和葉長的促生效應(yīng)優(yōu)于CK和其他單一促生菌，莖長和葉長較CK分別增加了24.06%和37.10%；Y-01+Y-02混合菌液處理番茄的葉綠素含量較CK增加3.78%，除了P-01和P-06、P-09、Y-01之外，其他單一促生菌處理的葉綠素含量均顯著高于Y-01+Y-02混合菌液，可見混合菌所有促生指標(biāo)并非都比單一菌株好。

表5 灌根15 d后不同秋海棠促生菌對(duì)番茄生長的影響Table 5 Effects of different growth promoting strains of Begonia grandis on growth of tomato after 15 d root irrigation

表6表明，灌根60 d后，Y-01+Y-02混合菌液與11種單一促生菌對(duì)番茄莖長、葉綠素含量和果實(shí)數(shù)量的促生效果均高于CK。其中菌株P(guān)-09處理番茄莖長最高，為(206.30±1.47) cm，比CK增加了34.55%，葉綠素含量也最高，比CK增加了13.25%。此外，P-09處理番茄果實(shí)數(shù)量也較高。

表6 灌根60 d后不同秋海棠促生菌對(duì)番茄生長的影響Table 6 Effects of different growth promoting strains of Begonia grondis on growth of tomato after 60 d root irrigation

3 結(jié)論與討論

在植物根際促生菌促生效應(yīng)的研究中，促生菌株的實(shí)際應(yīng)用效果非常重要，這方面已有許多報(bào)道。如段秀梅等[17]從植物根際的土壤樣品中分離篩選出2株高效解磷細(xì)菌P9和P28，研究表明，混合接種這2株解磷菌處理的玉米株高和干質(zhì)量比CK分別增加了35.5%和28.9%。Zhao等[18]通過接種促生菌使得金銀花鮮質(zhì)量增加16.48%。姚拓[19]研究表明，大多數(shù)促生菌株可以促進(jìn)燕麥的生長(株高、根長、根表面積和生物量)，接種聯(lián)合促生菌后，燕麥的株高和生物量分別增加35.40% 和33.70%。崔曉雙等[20]利用玉米、黃瓜、番茄3種作物的根系分泌物作為初篩培養(yǎng)基的營養(yǎng)源，從相對(duì)應(yīng)作物的根際土壤樣品中分離篩選出了能利用根系分泌物快速生長的菌株，并通過盆栽試驗(yàn)評(píng)價(jià)其促生效果，結(jié)果表明，番茄接種促生菌后，地上鮮質(zhì)量增加了38.58%～45.53%；黃瓜接種促生菌后，地上部鮮質(zhì)量增加17.49%～29.44%，且與CK有顯著差異。丁新景等[21]探討了阿氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)、彎曲芽孢桿菌(Bacillusflexus)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)對(duì)雪蓮生長的促生作用，結(jié)果表明，接種3種促生菌后，雪蓮植株葉綠素含量、根系體積和鮮質(zhì)量、地上部鮮質(zhì)量均顯著提高。本研究的盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，單一促生菌和Y-01+Y-02混合菌的促生效果有差異，接種單一促生菌的效果總體低于Y-01+Y-02混合菌，Y-01+Y-02混合菌處理大豆株高、根長、莖長、莖直徑和鮮質(zhì)量分別較CK增加了37.42%，25.65%，38.53%，16.42%和34.84%。這是因?yàn)榇偕鶼-01與Y-02間具有協(xié)同效應(yīng)，由于植物在幼苗初期自養(yǎng)能力較差，需要吸收大量營養(yǎng)物質(zhì)，而促生菌可調(diào)節(jié)植物幼苗初期的自養(yǎng)能力，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的積累，可為育苗壯苗提供保障，并且隨著植物促生菌的定殖，其促生作用明顯增加。

本研究的大田試驗(yàn)中，Y-01+Y-02混合菌液對(duì)灌根15 d番茄植株莖長和葉長的促生效果明顯，莖長和葉長較CK組分別增加了24.06%和37.10%；葉綠素含量較CK增加3.78%，但低于大部分單一促生菌。處理60 d后，P-09的莖長、葉綠素含量、果實(shí)數(shù)量均較高，促生作用優(yōu)于Y-01+Y-02混合菌處理?？梢娫诖筇镏心承﹩我淮偕拇偕饔脮?huì)優(yōu)于多菌混合處理。

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