3種血漿微小RNA提取方法的評價

黃學文， 潘 杰， 趙蘭靜， 吳 茵， 朱菊平

（華東療養(yǎng)院檢驗科，江蘇 無錫 214065）

目前，在人體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)700多種微小RNA（microRNA，miRNA）。功能學研究結(jié)果顯示，miRNA 參與調(diào)控幾乎所有細胞生命活動過程，在人類多種病理條件下均會發(fā)生表達量的變化，目前已被廣泛用于腫瘤、血液病和心血管疾病等的研究中，并可能成為疾病治療新的靶標和無創(chuàng)性診斷新的分子標志物[1-3]。

隨著血漿（血清）游離miRNA在臨床上的應用越來越廣泛，血漿（血清）游離miRNA提取顯得越來越重要。游離miRNA在正常人的血液中含量甚微，獲得高濃度、高質(zhì)量的游離miRNA是進行分子生物學研究的第一步，也是關(guān)鍵的一步。本研究對目前miRNA提取常用的2種方法即柱分離方法和TRIzol提取方法進行評價，以期掌握更好、更經(jīng)濟的miRNA提取方法，為下一步實驗提供方法學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取20名2016年10月20日來華東療養(yǎng)院體檢的志愿者作為研究對象，年齡35～55歲。全部研究對象乙型肝炎病毒血清標志物和丙型肝炎病毒血清抗體均為陰性，肝功能、腎功能、血脂和尿酸等生化指標正常，超聲波檢查證實肝、膽、脾、胰、腎無異常，X線、電子計算機斷層掃描及內(nèi)窺鏡檢查均正常。

1.2 方法

1.2.1 血漿的制備 采集所有研究對象體檢時的空腹靜脈血3 mL，加入含乙二胺四乙酸的BD抗凝管中，4 ℃ 1 900×g離心10 min，轉(zhuǎn)移上層血漿至新的1.5 mL Eppendorf管中，然后4 ℃ 16 000×g離心10 min，吸取上清-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 TRIzol法提取miRNA 取500 μL血漿，按照TRIzol試劑盒（美國Life公司）說明書進行RNA提取并溶解于35 μL焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarborate，DEPC）水中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?.2.3 進口硅膠吸附柱法提取miRNA 取200 μL血漿，用miRNA Neasy血清/血漿試劑盒（德國Qiagen公司）按說明書提取RNA并溶解于14 μL DEPC水中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 國產(chǎn)硅膠吸附柱法提取miRNA 取200 μL血漿，按照血漿/血清miRNA提取試劑盒（江蘇然科生物技術(shù)有限公司）說明書提取RNA并溶解于14 μL DEPC水中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 提取物中β-globin基因的檢測 用TaqMan聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）體系（日本Takara公司）檢測提取的RNA中的β-globin基因。具體步驟如下：2×PCR緩沖液12.5 μL，10 μmol/Lβ-globin基因上、下游引物各0.5 μL，10 μmol/L TaqMan-BHQ1探針0.75 μL，50×ROX 0.25 μL，DEPC水0.5 μL，提取物10 μL，總體積25 μL。擴增條件：95 ℃30 s，1個循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，40個循環(huán)。β-globin基因的上、下游引物及TaqMan-BHQ1探針由上海英駿公司合成，序列見表1。

1.2.6 逆轉(zhuǎn)錄 用逆轉(zhuǎn)錄體系（美國Life公司）進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，體系中包括：100 mmol/ L脫氧核糖核苷三磷酸0.15 μL、50 U/μL逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL、10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液1.5 L、20 U/μL RNA酶抑制劑0.19 μL、10 μmol/ L miRNA-21反轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物3 μL、DEPC水4.16 μL、提取物5 μL、總體積15 μL?；旌象w系放置冰上5 min，然后放入PCR儀進行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄反應條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置-20 ℃保存?zhèn)溆?。miRNA-21反轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物由上海英駿公司合成，序列見表1。

1.2.7 TaqMan-MGB探針檢測miRNA-21 用TaqMan-MGB探針PCR體系（江蘇昱安生物科技有限公司）進行miRNA-21檢測。熒光定量體系中包含：反應緩沖液4 μL，10 μmol/L miRNA-21上、下游引物各0.6 μL，10 μmol/L TaqMan-MGB探針0.4 μL，DEPC水12.15 μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，50×ROX 0.25 μL，總體積20 μL。熒光定量PCR擴增條件：95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；95 ℃5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。miRNA-21上、下游引物及TaqMan-MGB探針由上海英駿公司合成，序列見表1。

1.3 儀器

Heraeus Fresco 17/21冷凍微量離心機（美國Thermo公司），micromax微量離心機（美國Thermo公司），Bioer MB-102振蕩恒溫金屬?。ê贾莶┤展荆?，ABI ViiA 7DX熒光定量PCR儀（美國Life公司），ABI VERITI梯度PCR儀（美國Life公司）。

表1 引物及探針序列

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析及q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 國產(chǎn)、進口硅膠吸附柱法和TRIzol法提取物中β-globin基因的檢測

國產(chǎn)、進口硅膠吸附柱法和TRIzol法提取物中β-globin基因的Ct值分別為35.487±0.356、35.591±0.332和33.529±0.499，3種方法差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。國產(chǎn)和進口硅膠吸附柱法β-globin基因Ct值均明顯高于TRIzol法（P＜0.000 1），而國產(chǎn)和進口硅膠吸附法β-globin基因Ct值差異無統(tǒng)計學意義（P=0.345 4）。

2.2 國產(chǎn)、進口硅膠吸附柱法和TRIzol法miRNA-21的檢測

采用TaqMan-MGB探針qPCR 檢測miRNA-21。國產(chǎn)、進口硅膠吸附柱法和TRIzol法miRNA-21的Ct值分別為26.527±0.158、26.653±0.201和28.169±0.385，3種方法差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000 3）。國產(chǎn)硅膠吸附柱法miRNA-21的Ct值低于進口硅膠吸附柱法（P=0.033 7），國產(chǎn)和進口硅膠吸附柱法miRNA-21的Ct值均明顯低于TRIzol法（P＜0.000 1）。

3 討論

miRNA是一類長約19～24 nt的非編碼單鏈小RNA 分子，在大多數(shù)真核生物中表達，參與多種生物學信號通路的調(diào)節(jié)，組織或血清中miRNA 的異常表達與多種人類惡性腫瘤密切相關(guān)。越來越多的證據(jù)表明，差異表達的miRNA可作為疾病早期診斷、分子分型及預后判斷的指標，同時也可作為多種疾病，特別是腫瘤新的治療靶標。目前，miRNA已成為分子生物學、遺傳學和臨床醫(yī)學等領域的研究熱點[4-5]。

隨著血漿（血清）游離miRNA在臨床上的應用越來越廣泛，血漿（血清）游離miRNA提取顯得越來越重要。目前，miRNA提取方法主要有TRIzol法和柱分離方法。TRIzol法基本沿用了mRNA 的分離技術(shù)，未考慮miRNA與mRNA在物理性質(zhì)和存在方式上的差異，如miRNA在長度上遠小于mRNA。此外，miRNA在細胞中主要以蛋白復合體的方式存在，因此TRIzol法容易造成miRNA大量丟失[6]。隨著材料學的發(fā)展，柱分離提取方法可在一定程度上解決上述問題，但柱提取方法成本太高，約為TRIzol法的10倍，并且多為國外公司所壟斷。近年來，隨著技術(shù)的進步，國內(nèi)的柱分離提取方法已經(jīng)取得了長足的進步。

為了篩選更好、更經(jīng)濟的miRNA提取方法，為下一步實驗提供新的選擇，本研究采用國產(chǎn)、進口硅膠吸附柱法和TRIzol法分別提取20名志愿者血漿中的miRNA，比較3種方法提取的miRNA純度和濃度。根據(jù)文獻報道，血漿β-globin基因濃度可以代表DNA的量，因此可用TaqMan-BHQ1探針qPCR檢測提取物中的β-globin基因含量，以觀察RNA提取的純度。本研究結(jié)果顯示，國產(chǎn)和進口硅膠吸附柱法提取物中的β-globin基因Ct值明顯高于TRIzol法（P＜0.000 1），說明硅膠吸附柱法提取的miRNA純度較高，并且2種硅膠吸附柱法的β-globin基因Ct值均＞35，表明這2種方法提取的miRNA中的DNA量極低，提取的miRNA純度很高。另外，國產(chǎn)和進口硅膠吸附柱法提取物中的β-globin基因Ct值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明國產(chǎn)硅膠吸附柱法提取的miRNA純度也能達到進口硅膠吸附柱法的提取純度。為了觀察提取的miRNA濃度，本研究利用反轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物及TaqMan-MGB探針qPCR檢測3種方法提取物中miRNA-21的Ct值。結(jié)果顯示，國產(chǎn)和進口硅膠吸附柱法提取物中miRNA-21的Ct值均明顯低于TRIzol法（P＜0.000 1）。這進一步說明TRIzol法易造成miRNA丟失，硅膠吸附柱法能有效改善miRNA的提取效率[6]。國產(chǎn)硅膠吸附柱法miRNA-21的Ct值高于進口硅膠吸附柱法（P=0.033 7），說明國產(chǎn)硅膠吸附柱法提取的miRNA濃度稍高于進口硅膠吸附柱法。

綜上所述，硅膠吸附柱法提取miRNA在提取純度和濃度上均優(yōu)于傳統(tǒng)的TRIzol法，并且國產(chǎn)硅膠吸附柱法無論在miRNA提取的純度還是濃度上均與進口硅膠吸附柱法不相上下，完全可替代進口硅膠吸附柱法。

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