反復(fù)喘息嬰幼兒外周血Tc9細(xì)胞檢測及其臨床意義

于建秀， 錢 雷， 徐東暉， 劉光亮

（1.濱?？h人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 鹽城 224500；2. 濱海縣人民醫(yī)院兒科，江蘇 鹽城 224500）

反復(fù)喘息是嬰幼兒最常見的呼吸道疾病，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，超過1/3 的嬰幼兒在3歲前發(fā)作過喘息[1]。反復(fù)喘息以氣道狹窄和高反應(yīng)性為特征，可導(dǎo)致呼吸困難[2]，嚴(yán)重影響嬰幼兒的生活質(zhì)量，且比其他年齡哮喘患者有更高的死亡率[3]，生命早期的喘息還會增加生命后期哮喘的發(fā)病率[4-5]。但嬰幼兒反復(fù)喘息的發(fā)病機(jī)制尚不明確。近年來有研究表明，Tc9細(xì)胞可通過分泌白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-9發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，在啟動過敏反應(yīng)和促進(jìn)哮喘患者氣道炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[6]，但其在反復(fù)喘息發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚。本研究通過檢測反復(fù)喘息嬰幼兒外周血Tc9細(xì)胞比例，并分析其與血清細(xì)胞因子的相關(guān)性，闡明其在反復(fù)喘息疾病過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2015年11月—2016年5月在濱海縣人民醫(yī)院住院的反復(fù)喘息嬰幼兒（喘息組）34例，同時選取年齡、性別與之相匹配的健康嬰幼兒34名作為對照組。喘息組納入標(biāo)準(zhǔn)：喘息發(fā)作3次以上的住院嬰幼兒，年齡6個月～3歲，呼吸道癥狀首先是喘息和咳嗽，其次是呼吸急促、有啰音和呼吸困難，喘息治療停止超過1個月。喘息組排除標(biāo)準(zhǔn)：患嬰幼兒肺炎、使用免疫抑制藥物和患免疫系統(tǒng)疾病的患兒。對照組過敏原檢測均為陰性，無哮喘或鼻炎癥狀。本研究經(jīng)濱?？h人民醫(yī)院倫理委員會（EC/2015/06）批準(zhǔn)，獲得所有研究對象父母或監(jiān)護(hù)人的知情同意。研究對象的臨床資料見表1。

表1 研究對象的臨床特征

1.2 儀器及試劑

異硫氰酸熒光素（f l uorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）鼠抗人-CD3單克隆抗體、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）鼠抗人- CD8單克隆抗體、葉綠素蛋白偶聯(lián)物（peridinin chlorophyll protein cyanin 5.5，PerCP-cy5.5）鼠抗人-IL-9單克隆抗體及同型對照、紅細(xì)胞裂解液、Fix/Perm 破膜固定劑均購自美國BD公司。血清轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β、IL-9、IL-17A、IL-33及IL-4試劑購自美國Bio-rad公司。血清總IgE采用cobas 8000化學(xué)發(fā)光儀及配套試劑（瑞士羅氏公司）檢測，淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)采用XS-1000i血液分析儀及配套試劑（日本Sysmex公司）檢測。FACS Calibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。過敏原采用Allergy Screen過敏原診斷試劑盒（德國MEDIWISS Analytic GmbH公司）檢測。佛波醇12-肉豆酸酯13-酯活性（phorbol 12-myristate-13-acetate，PMA）、離子霉素及布雷菲德菌素購自美國Sigma公司。Ficoll-Hypaque密度梯度試劑購自上海恒信公司。

1.3 方法

1.3.1 外周血Tc9細(xì)胞比例的檢測 取肝素抗凝靜脈血100 μL，加入50 ng/mL PMA、1 μg/mL離子霉素及1 μg/mL布雷菲德菌素，于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)5 h。采用紅細(xì)胞裂解液破壞紅細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌后分別加入10 μL FITC鼠抗人-CD3單克隆抗體及10 μL PE鼠抗人-CD8單克隆抗體，室溫避光孵育30 min。用PBS洗滌后，加入250 μL Fix/Perm buffer 避光孵育40 min，加入300 μL Perm/wash buffer洗滌，離心棄上清。100 μL Perm/wash buffer 重懸細(xì)胞，加10 μL PerCP-cy5.5鼠抗人-IL-9單克隆抗體及同型對照，室溫避光孵育30 min，用PBS洗滌。用400 μL PBS重懸細(xì)胞，立即上機(jī)檢測。通過前向散射光和側(cè)向散射光分選淋巴細(xì)胞，以淋巴細(xì)胞設(shè)門，分選出CD3+CD8+細(xì)胞群（圖1），進(jìn)而檢測CD8+IL-9+細(xì)胞（Tc9細(xì)胞，圖2），通過IL-9同型對照調(diào)節(jié)電壓及補(bǔ)償，測定外周血Tc9細(xì)胞占CD3+CD8+T細(xì)胞百分率（Tc9細(xì)胞比例）。

圖1 CD8+T淋巴細(xì)胞（R2）流式散點(diǎn)圖

圖2 Tc9細(xì)胞流式散點(diǎn)圖

1.3.2 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）分析 通過Ficoll-Hypaque法制備外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），利用Trizol試劑提取總RNA。采用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Applied Biosystems公司）進(jìn)行cDNA合成，利用QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒（美國Invitrogen公司）進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列為：IL-9 sense，5'-GTGCCACTGCAGTGCTAATGT-3'，antisense，5'-CTCTCACTAAGCATGGTCTGG-3'。IRF4 sense：5'-GAAGCCTTGGCGTTCTCAGAC-3'；anti-sense：5'-CGTATGTCCATGGGAGATCCG-3'。β-actin sense：5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'；anti-sense：5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。在ABI 7500 PCR擴(kuò)增儀（美國Applied Biosystems公司）上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR。采用2-△△Ct方法計算IL-9 mRNA和干擾素調(diào)節(jié)因子4（interferon regulatory factor 4，IRF4）mRNA水平。

1.3.3 血清細(xì)胞因子檢測 采集所有研究對象外周血2 mL，500×g離心5 min，分離血漿，立即置于-80 ℃冰箱。采用LUMINEX 200液相芯片分析系統(tǒng)（美國Luminex公司）檢測IL-9、IL-17A、IL-33、IL-4和TGF-β水平，每份樣本檢測2次，取均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

運(yùn)用Stata 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。偏態(tài)計量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；正態(tài)分布計量數(shù)據(jù)用x±s表示，2組間比較采用Students' t檢驗。采用Spearman相關(guān)分析計算線性相關(guān)系數(shù)。以P＜0.05為異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血Tc9細(xì)胞比例和IL-9 mRNA、IRF4 mRNA的檢測

與對照組比較，喘息組外周血Tc9細(xì)胞比例和PBMCIL-9 mRNA、IRF4 mRNA水平明顯升高（P＜0.05）。見表2。

表2 喘息組和對照組外周血Tc9細(xì)胞比例及PBMC IL-9 mRNA、IRF4 mRNA水平的比較 [M（P25，P75）]

2.2 喘息組外周血Tc9細(xì)胞比例與PBMC IL-9 mRNA、IRF4 mRNA的相關(guān)性

喘息組外周血Tc9細(xì)胞比例與PBMCIL-9 mRNA、IRF4 mRNA水平呈正相關(guān)（r值分別為0.501、0.504，P=0.002）。見圖3。

2.3 喘息組與對照組與外周血Tc9細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子水平的比較

與對照組比較，喘息組外周血IL-9、TGF-β1、IL-4和IL-33水平明顯升高（P＜0.05），但2個組間IL-17A水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

圖3 喘息組外周血Tc9細(xì)胞比例與IL-9 mRNA、IRF4 mRNA的相關(guān)性

表3 喘息組與對照組血清細(xì)胞因子水平的比較 [M（P25，P75）]

2.4 喘息組外周血Tc9細(xì)胞比例和血清細(xì)胞因子、總IgE的相關(guān)性

喘息組外周血Tc 9細(xì)胞比例與總I g E和IL-9呈正相關(guān)（r=0.354，P=0.039；r=0.459，P=0.006），與IL-33、IL-4和TGF-β1無相關(guān)性（r=0.241，P=0.169；r=0.252，P=0.153；r=0.236，P=0.178）。見圖4。

圖4 喘息組外周血Tc9細(xì)胞比例與總IgE、IL-9的相關(guān)性

2.5 過敏原陽性喘息組外周血Tc9細(xì)胞比例

在喘息組中，過敏原陽性患兒Tc9細(xì)胞比例[3.11（1.96，4.57）%，11例]明顯高于過敏原陰性患兒[1.67（0.67，3.26）%，23例]（P＜0.05）。

3 討論

通過哮喘鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，Tc9細(xì)胞對Th2介導(dǎo)的呼吸道炎癥反應(yīng)具有促進(jìn)作用，同時對與哮喘有相似發(fā)病機(jī)制的特應(yīng)性皮炎患兒進(jìn)行研究，特應(yīng)性皮炎患兒外周血Tc9細(xì)胞增多，并與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，其機(jī)制是Tc9細(xì)胞通過分泌IL-9而發(fā)揮作用[6]。Tc9細(xì)胞可由IL-4聯(lián)合TGF-β誘導(dǎo)CD8+初始T細(xì)胞產(chǎn)生，信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子6和IRF4是調(diào)控Tc9細(xì)胞發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子。本研究發(fā)現(xiàn)，喘息組患兒外周血Tc9細(xì)胞比例顯著升高，且與PBMCIRF4 mRNA和IL-9 mRNA具有相關(guān)性。

IL-9是一種多效性細(xì)胞因子，既是T細(xì)胞生長因子，又可直接作用于B細(xì)胞，促進(jìn)IL-4介導(dǎo)的B細(xì)胞分化及IgE的表達(dá)，在免疫球蛋白合成的調(diào)控中發(fā)揮重要的作用[7]。IL-9可促使肥大細(xì)胞增殖，增加肥大細(xì)胞表面 Fc受體I a的表達(dá)和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，促使肥大細(xì)胞對變應(yīng)原作出反應(yīng)。在過敏性哮喘中，IL-9可通過抑制嗜酸性粒細(xì)胞的凋亡和促進(jìn)IL-5介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞前體的成熟來增加組織中嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生和釋放IL-8，從而招募更多的中性粒細(xì)胞，參與中性粒細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)[8]。IL-9可刺激上皮細(xì)胞，導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞和T細(xì)胞的浸潤，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞產(chǎn)生黏蛋白，從而在炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[9]。IL-9的來源除了Tc9細(xì)胞外，Th9細(xì)胞、先天性淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等多種細(xì)胞均可產(chǎn)生IL-9[10]。本研究表明外周血Tc9細(xì)胞比例與IL-9水平具有相關(guān)性，表明Tc9細(xì)胞是IL-9的重要來源之一。

與CD4+T細(xì)胞的分類相似，CD8+T細(xì)胞分為Tc1、Tc2、Tc17、Tc9、CD8+Treg等細(xì)胞亞群，并參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展[11]。CD8+初始T細(xì)胞向不同亞群分化的方向決定于抗原的性質(zhì)和強(qiáng)度、協(xié)同刺激分子和細(xì)胞因子。TGF-β誘導(dǎo)CD8+初始T細(xì)胞向CD8+Treg細(xì)胞分化，在IL-4作用下向Tc2細(xì)胞分化，但在TGF-β和IL-6存在的條件下分化為Tc17細(xì)胞。Tc9細(xì)胞的發(fā)育、分化由細(xì)胞因子TGF-β和IL-4誘導(dǎo)。此外，通過核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的活化，IL-1β和IL-33的刺激也可誘導(dǎo)Tc9細(xì)胞分化[12]。

本研究表明，喘息組血清TGF-β1水平顯著高于對照組（P＜0.05）。有較多的研究表明，TGF-β1與哮喘的發(fā)生存在密切的聯(lián)系[13-14]。首先，TGF-β1基因多態(tài)性與哮喘的發(fā)病率增加有關(guān)。CHIANG等[15]發(fā)現(xiàn)血清TGF-β1的升高、哮喘的易發(fā)性及病情嚴(yán)重程度與TGF-β1基因啟動子C-509T異常有密切的關(guān)系。另外，哮喘患兒外周血和支氣管肺泡灌洗液TGF-β水平顯著升高，且與支氣管中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞增加有關(guān)，提示TGF-β參與了哮喘的發(fā)生和病情加重過程[16]。本研究還證實，喘息組血清IL-4水平明顯升高。因此，血清中TGF-β和IL-4升高可能是反復(fù)喘息嬰幼兒外周血Tc9細(xì)胞比例升高的重要因素。

上皮細(xì)胞因子IL-33是新發(fā)現(xiàn)的IL-1家族成員，是一種多功能蛋白，其受體為細(xì)胞表面腫瘤發(fā)生抑制蛋白2，表達(dá)于Th2細(xì)胞和肥大細(xì)胞等細(xì)胞膜表面。IL-33結(jié)合受體ST2后能促進(jìn)T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和先天性淋巴細(xì)胞反應(yīng)，誘導(dǎo)效應(yīng)因子IL-5、IL-13生成，促進(jìn)B細(xì)胞活化，誘導(dǎo)IgE合成，增多的IgE可介導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒，誘導(dǎo)哮喘的發(fā)生。另外，IL-33也參與了Th9細(xì)胞的分化和加劇兒童哮喘的病程[17]。本研究也證實喘息組血清IL-33水平升高。與本研究結(jié)果一致的是，IL-33也是一種糖皮質(zhì)激素抵抗介質(zhì)，可加重兒童哮喘的癥狀[18]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，喘息組外周血Tc9細(xì)胞比例與IgE水平呈正相關(guān)，且在喘息組中血清過敏原陽性患兒外周血Tc9細(xì)胞比例高于過敏原陰性患兒（P＜0.05）。氣道微生物、環(huán)境因素和先天免疫應(yīng)答三者之間的相互作用是喘息的重要發(fā)病機(jī)制[19]。有流行病學(xué)研究結(jié)果表明，反復(fù)喘息的病因包括過敏、呼吸道感染和早期喘息[20]。另外，WANG等[21]研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者Tc9細(xì)胞比例升高，在接受糖皮質(zhì)激素治療后Tc9細(xì)胞比例降低。

綜上所述，反復(fù)喘息嬰幼兒外周血Tc9細(xì)胞比例、IL-9 mRNA水平升高，與Tc9細(xì)胞分化相關(guān)的細(xì)胞因子IL-9、TGF-β1、IL-4和IL-33水平也升高，且Tc9細(xì)胞比例與總IgE水平呈正相關(guān)，過敏原陽性患兒外周血Tc9細(xì)胞比例明顯升高。以上結(jié)果表明Tc9細(xì)胞在反復(fù)喘息的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。因此，通過調(diào)控Tc9細(xì)胞比例及其功能可能是治療反復(fù)喘息的重要途徑。

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