miR-24-3p靶向KLF6基因調控IL-6/STAT3信號通路影響食管癌細胞的活力和凋亡*

張 倬，熊 飛，陳天佑，李雪曼，張 程，劉 沖

(武漢市第三醫(yī)院胸外科， 湖北 武漢 430060)

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類高度保守的非編碼小分子RNA，長度為18～25個核苷酸，廣泛存在于生物體內。miRNA可特異性識別靶基因mRNA的3′UTR，并能夠與其結合，降解mRNA或抑制mRNA翻譯，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關鍵調控作用[1]。研究顯示，miR-24-3p在食管鱗狀細胞癌組織和癌細胞ECA-109中表達上調，參與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展[2]。miR-24在食管鱗狀細胞癌患者血清中表達上調，其表達水平與放療敏感性密切相關[3]。生物信息學顯示，miR-24-3p可靶向調控Kruppel樣因子6(Kruppel-like factor 6，KLF6)表達。KLF6是KLF家族基因編碼蛋白質的轉錄調控因子，在多種腫瘤組織或細胞中表達下調，其表達水平與腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等密切相關[4]。研究顯示，KLF6在口腔癌組織中表達下調，其低表達的患者預后較差，KLF6過表達可抑制口腔癌SAS細胞的遷移和侵襲[5]。目前，miR-24-3p和KLF6對食管癌細胞增殖、凋亡的影響及其作用機制的研究還很少見。本研究主要探討了下調miR-24-3p表達以及敲減KLF6表達對食管癌細胞的活力和凋亡的影響，并證實miR-24-3p在食管癌細胞中與KLF6的靶向調控關系，分析miR-24-3p作用的分子機制，以期為食管癌的治療提供新靶點。

材 料 和 方 法

1 細胞和實驗試劑

食管癌細胞TE11購自南京安研生物科技有限公司；食管癌細胞Eca109和EC9706細胞由中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室惠贈；人正常食管上皮細胞株HEEC購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco；四甲基偶氮唑鹽(MTT)和二甲基亞砜購自Sigma；LipofectamineTM2000試劑盒購自上海瓦蘭生物科技有限公司；TRIzol試劑購自Invitrogen；逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒購自MBI；引物序列由上海生工生物有限公司設計提供；miRNA mimics及抑制劑購自吉瑪公司；抗細胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-depen-dent kinases 4, CDK4)、細胞周期蛋白D1(cyclin D1)和細胞分裂周期蛋白25A(cell division cycle protein 25A, CDC25A)抗體購自北京中山生物技術有限公司；抗caspase-3、Bax和Bcl-2抗體購自Abcam；抗信號轉導子與轉錄激活子3(signal transducer and activator of transcription, STAT3)、p-STAT3抗體購自Santa Cruz；Annexin V/PI試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

2 實驗方法

2.1細胞培養(yǎng) 復蘇食管癌TE11、Eca109和EC9706細胞以及人正常食管上皮HEEC細胞，加入含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、97%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合至80%左右時，胰酶消化，進行后續(xù)實驗。調整細胞濃度為1×108/L，接種于6孔板中，每孔1 mL。培養(yǎng)24 h后收集細胞，RT-qPCR檢測細胞中miR-24-3p和KLF6 mRNA的表達，Western blot檢測KLF6蛋白的表達。

2.2細胞轉染 EC9706細胞接種到6孔板中，融合至60%時，參照LipofectamineTM2000試劑盒操作說明轉染。細胞轉染首先分為4組，EC9706細胞轉染miR-control、miR-24-3p mimics、anti-miR-control和anti-miR-24-3p；然后再增加KLF6低表達轉染組，分為anti-miR-control+si-control和anti-miR-control+si-KLF6兩組。轉染6 h后，更換新鮮的含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。分別收集各組細胞培養(yǎng)上清液和細胞用于后續(xù)實驗。

2.3RT-qPCR檢測細胞中miR-24-3p和KLF6 mRNA的水平 收集各組細胞，加入TRIzol試劑提取總RNA。參照逆轉錄試劑盒操作說明，將RNA逆轉錄后進行PCR擴增。miR-24-3p的上游引物序列為5′-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3′，下游引物序列為5′-ACCGAGUCAAGUCGUCCUUGUC-3′；KLF6的上游引物序列為5′-TGCTACTTGAAAGCACGCCA-3′，下游引物序列為5′-CAGCCTTGCCTTGACCATCT-3′；U6的上游引物序列為5′-CTGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；β-actin的上游引物序列為5′-ATTGCCGACAGGATGCAGA-3′，下游引物序列為5′ -GAGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3′。擴增條件為:95 ℃ 3 min；95 ℃15 s、60 ℃ 30 s，共進行40個循環(huán)。miR-24-3p以U6為內參照，KLF6以β-actin為內參照，采用 2-ΔΔCt法計算miR-24-3p和KLF6 mRNA的相對表達水平。

2.4Western blot檢測蛋白表達 取各組細胞，加入RIPA蛋白裂解液置于冰上充分裂解，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。取上清液，BCA法對蛋白進行定量。取適量蛋白質，進行SDS-PAGE。電泳后，將分離的蛋白電轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉2 h。加入 I 抗，4 ℃搖床孵育過夜。TBST漂洗后，加入 II 抗，室溫條件反應2 h。TBST漂洗后，加入ECL避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

2.5雙螢光素酶報告基因實驗 EC9706細胞以每孔1×105個接種到24孔板中，細胞融合至60%時進行轉染。分別向EC9706細胞中轉染miR-control和miR-24-3p mimics。48 h后，將0.2 μg KLF6-3′UTR-WT或KLF6-3′UTR-MUT與 0.02 μg質粒共轉染至每孔細胞中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，更換新鮮的含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。PBS洗滌細胞3次后，棄盡洗液，每孔中加入200 μL細胞裂解液，振蕩裂解細胞 15 min，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，吸出上清液，加入至空白不透明的96孔板中。參照雙螢光素酶活性檢測試劑盒說明書，檢測并計算相對螢光素酶活性。

2.6MTT檢測細胞活力 對數(shù)期生長的EC9706細胞，胰酶消化，調整細胞濃度為1×107/L，接種于96孔板中，每孔200 μL。接種12 h后，常規(guī)轉染。轉染后分別再培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，孵育10 min，混合均勻，于酶標儀490 nm處測定吸光度(A)值。

2.7流式細胞術檢測細胞凋亡 轉染48 h后的各組細胞，胰酶消化制成單細胞懸液，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，吸棄上清液，PBS洗滌2次，調整細胞濃度為1×109/L。參照Annexin V/PI試劑盒操作說明書進行染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。每組細胞重復檢測3次。

2.8ELISA檢測IL-6水平 取收集的細胞培養(yǎng)上清液，參照IL-6 ELISA檢測試劑盒操作說明，檢測上清液中IL-6的表達水平。

3 統(tǒng)計學處理

SPSS 22.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 食管癌細胞和正常食管上皮細胞中miR-24-3p和KLF6的差異表達

與HEEC細胞比，食管癌TE11、Eca109和EC9706細胞中miR-24-3p的表達顯著上調(P<0.05)，KLF6 mRNA和蛋白表達顯著下調(P<0.05)，表明食管癌細胞中miR-24-3p呈高表達，KLF6呈低表達。本實驗選擇EC9706細胞用于后續(xù)實驗。見圖1。

Figure 1. The expression of miR-24-3p (A) and KLF6 mRNA (B) and protein (C) in esophageal cancer cells and normal esophageal epithelial cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHEEC cells.
圖1 食管癌細胞和正常食管上皮細胞中miR-24-3p和KLF6的表達

2 miR-24-3p靶向負調控KLF6的表達

TargetScan靶基因測序工具顯示，KLF6的3′UTR中含有與miR-24-3p互補的核苷酸序列，見圖2A。為了證實miR-24-3p靶向調控KLF6表達，構建KLF6野生型及突變型質粒進行雙螢光素酶報告基因實驗，結果顯示與miR-control組相比，轉染miR-24-3p mimics的WT組EC9706細胞的螢光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而較轉染miR-24-3p mimics的MUT組EC9706細胞的螢光素酶活性無顯著性改變(P>0.05)，說明miR-24-3p在EC9706細胞中靶向調控KLF6表達，見圖2B。Western blot檢測結果顯示，轉染miR-24-3p mimics組的KLF6蛋白水平顯著低于miR-control組(P<0.05)，轉染anti-miR-24-3p組的KLF6蛋白水平顯著高于anti-miR-control組(P<0.05)，進一步說明miR-24-3p在EC9706細胞中靶向負調控KLF6的表達，見圖2C。

Figure 2. miR-24-3p has complementary sequences with KLF6 3′UTR and regulates the expression of KLF6 proteins. A:targeting sequence information of miR-24-3p and KLF6 3′ UTR; B: detection of double luciferase activity; C: the protein expression of KLF6. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-control group;#P<0.05vsanti-miR-control group.
圖2 miR-24-3p靶向調控KLF6的表達

3 miR-24-3p和KLF6表達對EC9706細胞活力的影響

RT-qPCR檢測結果顯示，anti-miR-24-3p組EC9706細胞的miR-24-3p表達水平顯著低于anti-miR-control組(P<0.05)，說明miR-24-3p低表達的EC9706細胞構建成功，見圖3A。MTT檢測結果顯示，培養(yǎng)72 h時，anti-miR-24-3p組EC9706細胞的A值顯著低于anti-miR-control組(P<0.05)，說明敲減miR-24-3p表達可抑制EC9706細胞的活力。Western blot檢測結果顯示，與anti-miR-control組相比，anti-miR-24-3p組EC9706細胞中的CDK4、cyclin D1和CDC25A蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，說明下調miR-24-3p表達可抑制與EC9706細胞增殖相關的蛋白表達。分別將anti-miR-24-3p與si-control和si-KLF6共轉染至EC9706細胞，結果顯示，與anti-miR-24-3p+si-control組比，anti-miR-24-3p+si-KLF6組的miR-24-3p表達、培養(yǎng)72 h時細胞A值以及CDK4、cyclin D1和CDC25A蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，說明敲減KLF6表達可逆轉下調miR-24-3p表達對EC9706細胞活力的抑制作用，見圖3。

Figure 3. Knockdown ofKLF6expression reversed the inhibitory effect of down-regulation of miR-24-3p expression on EC9706 cell proliferation.A:effect of transfection of anti-miR-24-3p and si-KLF6 on the expression of miR-24-3p in EC9706 cells;B:effects of miR-24-3p and KLF6 on the viability of EC9706 cells; C:effect of miR-24-3p and KLF6 on the expression of CDK4, cyclin D1 and CDC25A.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsanti-miR-control group;#P<0.05vsanti-miR-24-3p+si-control group.
圖3 敲減KLF6表達逆轉下調miR-24-3p表達對EC9706細胞活力的抑制作用

4 miR-24-3p和KLF6表達對EC9706細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果顯示，anti-miR-24-3p組EC9706細胞凋亡率顯著高于anti-miR-control組(P<0.05)，說明敲減miR-24-3p表達可促進EC9706細胞凋亡，見圖4A。Western blot檢測結果顯示，與anti-miR-control組比，anti-miR-24-3p組EC9706細胞中caspase-3和Bax蛋白水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)，說明下調miR-24-3p表達可促進EC9706細胞caspase-3和Bax蛋白表達，抑制Bcl-2表達，見圖4B。分別將anti-miR-24-3p與si-control和si-KLF6共轉染至EC9706細胞，結果顯示，與anti-miR-24-3p+si-control組比，anti-miR-24-3p+si-KLF6組細胞的凋亡率顯著降低(P<0.05)，caspase-3和Bax蛋白水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)，說明沉默KLF6可逆轉下調miR-24-3p表達對EC9706細胞凋亡的促進作用，見圖4。

Figure 4. Knockdown ofKLF6expression reversed the effect of miR-24-3p inhibitor on apoptosis of EC9706 cells. A:the effects of miR-24-3p and KLF6 on apoptosis of EC9076 cells:B:the effects of miR-24-3p and KLF6 on the expression of caspase-3, Bax and Bcl-2. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsanti-miR-control group;#P<0.05vsanti-miR-24-3p+si-control group.
圖4 敲減KLF6表達恢復miR-24-3p抑制物對EC9706細胞凋亡的促進作用

5 miR-24-3p和KLF6表達對EC9706細胞IL-6/STAT3信號通路的影響

ELISA和Western blot檢測結果顯示，與anti-miR-control組比，anti-miR-24-3p組EC9706細胞的IL-6水平和p-STAT3蛋白水平均顯著降低；而與anti-miR-24-3p+si-control組比，anti-miR-24-3p+si-KLF6組細胞的IL-6水平和p-STAT3的蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，說明miR-24-3p調控KLF6表達可影響EC9706細胞IL-6/STAT3信號通路，見圖5。

Figure 5. miR-24-3p affected IL-6/STAT3 signaling pathway in EC9706 cells by regulating KLF6 expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsanti-miR-control group;#P<0.05vsanti-miR-24-3p+si-control group.
圖5 miR-24-3p調控KLF6表達影響EC9706細胞IL-6/STAT3信號通路

討 論

食管癌是世界范圍內嚴重威脅人類生命健康的常見惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率[6]。食管癌患者的惡性程度高，多數(shù)患者確診時已處于晚期，預后較差[7]。由于醫(yī)學水平的進步，患者預后有了較大改善，但5年生存率依然較低[8]。近年來研究表明，miRNA與食管癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等密切相關[9-10]，參與食管癌的發(fā)生發(fā)展，探討miRNA對食管癌細胞生物學特性的影響，對其診斷和治療以及患者預后有重要意義。

miR-24-3p是miR-24的亞型之一，在多種腫瘤中表達異常，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。研究顯示，miR-24-3p在膀胱癌組織中表達升高，其高表達可促進膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并抑制細胞凋亡，是膀胱癌治療的潛在靶點[11]。miR-24-3p通過直接靶向SOX7促進肺癌細胞的增殖和遷移[12]。目前，miR-24-3p對食管癌細胞增殖和凋亡的研究還未見報道。本研究結果顯示，食管癌TE11、Eca109和EC9706細胞中miR-24-3p表達顯著上調，轉染anti-miR-24-3p的EC9706細胞A值顯著降低，細胞凋亡率升高，說明下調miR-24-3p表達可抑制EC9706細胞活力，誘導其凋亡，提示miR-24-3p在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要調控作用，可能是食管癌治療的潛在靶點。細胞增殖依賴于細胞周期的順利進行，細胞周期與細胞周期調控蛋白和依賴性激酶的正常表達密切相關。Cyclin D1是細胞周期G1期的關鍵調控蛋白，其含量及活化程度可限制細胞周期中G1/S期的轉換過程[13]。細胞周期依賴性激酶4是G1期的的重要調控分子，正向調控細胞周期，其高表達促進惡性腫瘤的惡化進程[14]。CDC25A促進G1向S期及G2向M期過渡，其表達異?？蓪е录毎芷谖蓙y，促進腫瘤細胞增殖[15]。本研究結果顯示，下調miR-24-3p表達可抑制EC9706細胞中cyclin D1、CDK4和CDC25A蛋白表達，提示miR-24-3p可能通過調控與細胞周期相關蛋白的表達進而抑制EC9706細胞活力。Caspase-3、Bax和Bcl-2 蛋白與細胞的凋亡密切相關。本研究結果顯示，下調miR-24-3p表達可促進Caspase-3和Bax蛋白表達，抑制Bcl-2蛋白表達，提示miR-24-3p通過影響與凋亡相關的蛋白誘導食管癌細胞凋亡。

TargetScan靶基因測序工具顯示，KLF6的3′UTR中含有與miR-24-3p互補的核苷酸序列，miR-24-3p可能調控KLF6表達。本研究結果顯示，食管癌細胞中KLF6 mRNA和蛋白表達水平降低，與相關研究報道結果一致[16]，提示KLF6 作為抑癌基因參與食管癌的發(fā)展進程。為了進一步探討miR-24-3p調控食管癌細胞增殖和凋亡的分子機制，本研究采用雙螢光素酶報告基因實驗證實了miR-24-3p在EC9706細胞中靶向負調控KLF6表達。

IL-6/STAT3信號通路是腫瘤細胞增殖和凋亡關系密切的信號傳導通路之一[17]。IL-6是一種多效能的細胞因子，其通過結合可溶性IL-6受體形成IL-6/sIL-6R復合物，進而活化細胞膜表面的gpl30，激活并維持STAT3的磷酸化水平[18]。STAT3是STATs家族的重要成員之一，在免疫細胞和腫瘤細胞中起關鍵作用[19]。STAT3的異常活化與腫瘤的發(fā)生密切相關。STAT3被激活后調控相關關鍵基因的表達，促進細胞增殖、遷移和侵襲、抗細胞凋亡等，進而表現(xiàn)出致癌作用[20]。本研究結果顯示，下調miR-24-3p表達可降低EC9706細胞IL-6水平以及p-STAT3蛋白水平，提示miR-24-3p可調控IL-6/STAT3信號通路；而沉默KLF6能夠消除下調miR-24-3p表達對EC9706細胞IL-6及p-STAT3表達的抑制作用，提示miR-24-3p可能通過靶向調控KLF6抑制IL-6/STAT3信號通路參與EC9706細胞的生長和凋亡。

綜上所述，食管癌細胞中miR-24-3p呈高表達，KLF6呈低表達。下調miR-24-3p表達可抑制食管癌細胞的生長，誘導其凋亡，而沉默KLF6可抑制miR-24-3p低表達對食管細胞的活力和凋亡的影響，其機制可能與影響IL-6/STAT3信號通路有關。