PHLPP1與PHLPP2在胃腸間質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義△

朱 輝 王淑君 夏 溪 謝林文 張亞兒 吳建勝

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬慈溪醫(yī)院消化內(nèi)科 溫州 315300)

胃腸間質(zhì)瘤(GIST)是胃腸道最常見(jiàn)的間葉組織來(lái)源腫瘤，多發(fā)生于50歲以上的老年人，男性發(fā)病率高于女性。因GIST對(duì)常規(guī)放化療缺乏敏感性，臨床多給予以手術(shù)為主的綜合療法，與其他類型的良性腫瘤不同，其生物學(xué)行為具有不可預(yù)測(cè)性，術(shù)后仍存在較高的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[1]。目前，GIST的侵襲性主要借助核分裂數(shù)和腫瘤大小進(jìn)行評(píng)估，是影響患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，但影響其侵襲性的病理生理機(jī)制尚未完全明確。PHLPP蛋白是一種富含亮氨酸的磷酸酶，能夠使磷酸化的蛋白激酶(P-AKT)脫磷酸化，抑制腫瘤相關(guān)信號(hào)通路磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶(PI3K/AKT)通路的活性，終止細(xì)胞惡性增值，與腫瘤細(xì)胞的行為學(xué)特征和侵襲性密切相關(guān)[2～3]。當(dāng)前研究背景下，PHLPP蛋白與腫瘤病理的相關(guān)性研究多聚焦于惡性腫瘤，而對(duì)GIST的研究較少，本研究推測(cè)GIST的細(xì)胞行為也可能受到PHLPP蛋白的影響，該實(shí)驗(yàn)立足于該假說(shuō)，通過(guò)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)分析PHLPP1與PHLPP2在GIST中的表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對(duì)象為本院2012年7月～2015年7月收治的29例胃腸道間質(zhì)瘤患者。包括男17例，女12例；年齡47～73例，平均(58.2±8.5)例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)初診為胃腸間質(zhì)瘤，無(wú)既往治療史；(2)術(shù)后病理和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)確診為胃腸道間質(zhì)瘤；(3)以手術(shù)為主要治療方案，且留有術(shù)后病理組織；(4)臨床診治、核分裂數(shù)、隨訪等資料齊全；(5)術(shù)前無(wú)遠(yuǎn)處病灶轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有其他系統(tǒng)腫瘤；(2)隨訪期間死于其它疾病；(3)合并有免疫系統(tǒng)或血液系統(tǒng)功能異常；(4)合并有糖尿病、急性外傷等能引起全身炎性反應(yīng)的其他疾病。

1.2 分組方法

所有病例的病理組織，均制備石蠟病理切片，于50倍鏡下觀察核分裂像數(shù)，根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院確立的胃腸間質(zhì)瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為極低危組9例、低危組13例、中危組和高危組8例。極低危組：腫瘤最大徑<2cm，核分裂像數(shù)<5/50；低危組：腫瘤最大徑2～5cm，核分裂像數(shù)<5/50；中危組：腫瘤最大徑<5cm且核分裂像數(shù)6～10/50，或腫瘤最大徑5～10cm且核分裂像數(shù)<5/50；高危組：腫瘤最大徑>5cm且核分裂像數(shù)<5/50，或腫瘤最大徑>10cm，或核分裂像數(shù)>10/50。

1.3 PHLPP1與PHLPP2表達(dá)水平測(cè)定方法

所得術(shù)后病理組織，均制備常規(guī)石蠟病理切片，厚度5～7μm，采用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)定PHLPP1與PHLPP2表達(dá)水平。主要步驟：(1)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，濃度梯度分別為100%、95%、85%、75%、60%、50%、30%、純水，各個(gè)梯度浸泡時(shí)間均為5min；(2)3%的H2O2處理10min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，置于玻片架，浸泡于裝滿0.01M枸櫞酸緩沖液的大燒杯，采用微波爐進(jìn)行抗原熱修復(fù)，先以中高火加熱至沸，自然冷卻，再以微波爐加熱至沸騰，自然冷卻，如此反復(fù)兩次；(3)PBS洗滌3次×5min，5%的BSA液封閉20min，激進(jìn)型抗體孵育。一抗孵育條件為4℃過(guò)夜，使用濃度為1∶500，PBS洗滌3次×5min，二抗孵育條件為37℃ 30min，使用濃度1∶800；(4)PBS洗滌3次×5min，鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidin-biotin complex，SABC)染色，37℃孵育30min，PBS洗滌3次×5min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，濃度梯度分別為30%、50%、60%、75%、85%、95%、100%，各個(gè)梯度浸泡時(shí)間均為5min。二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片；(5)電子顯微鏡下觀察染色后切片，染成黃色或棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞，直接采用ImagePro Plus軟件分析陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度。

1.4 資料統(tǒng)計(jì)方法

采用Execl表格統(tǒng)計(jì)患者的臨床資料，包括年齡、性別、確診時(shí)間、主要臨床癥狀與體征、病理診斷數(shù)據(jù)、治療方式、術(shù)后隨訪時(shí)間、隨訪期有無(wú)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等。復(fù)發(fā)：原病灶區(qū)域出現(xiàn)腫瘤；轉(zhuǎn)移：原病灶以外的其他位置出現(xiàn)腫瘤。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，本組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，多組間的比較行方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異者進(jìn)一步行LSD-T檢驗(yàn)，兩組間比較行兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，因總病例數(shù)<40，以Fisher確切概率法分析組間差異；術(shù)后生存曲線的繪制和分析采用Kaplan-Meier法；P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組的PHLPP1與PHLPP2表達(dá)水平

各組患者的病理組織PHLPP1與PHLPP2表達(dá)水平明顯不同，極低危組的PHLPP1與PHLPP2表達(dá)水平高于低危組，低危組高于中高危組，任意兩組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組患者PHLPP1與PHLPP2表達(dá)水平比較

組別例數(shù)PHLPP1PHLPP2極低危組93．635±0．6253．512±0．825低危組132．024±0．364?2．884±0．527?中高危組80．886±0．225?#1．853±0．413?#

注：*與極低危組相比，P<0.05；#與低危組相比，P<0.05。

2.2 各組的預(yù)后評(píng)估

本組病例術(shù)后隨訪時(shí)間為1～3年，至末次隨訪期，極低危組患者均無(wú)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡；低危組復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移各1例，死亡1例；中高危組患者復(fù)發(fā)2例，轉(zhuǎn)移3例，死亡3例。以復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移與死亡患者為預(yù)后不良，中高危組的預(yù)后不良發(fā)生率明顯高于極低危組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率和死亡率對(duì)比 [n(%)]

組別例數(shù)復(fù)發(fā)率轉(zhuǎn)移率死亡率預(yù)后不良極低危組90000低危組131(7．7)1(7．7)1(7．7)2(15．4)中高危組82(25．0)3(37．5)3(37．5)5(62．5)?

注：*與極低危組相比，P<0.05。

2.3 預(yù)后不良患者的PHLPP1與PHLPP2表達(dá)水平

以復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移與死亡患者為預(yù)后不良，其他患者為預(yù)后良好，對(duì)比分析預(yù)后不良患者的PHLPP1與PHLPP2表達(dá)特點(diǎn)，結(jié)果顯示預(yù)后不良患者的PHLPP1與PHLPP2表達(dá)水平明顯低于預(yù)后良好者(P<0.05)，見(jiàn)表3。ROC曲線分析結(jié)果顯示，PHLPP1與PHLPP2表達(dá)水平對(duì)預(yù)后不良均有預(yù)測(cè)價(jià)值(P<0.05)，其最佳截點(diǎn)分別為PHLPP1=1.810和PHLPP2=2.625，PHLPP1=1.810評(píng)估預(yù)后不良的敏感度為0.957，特異度為0.714；PHLPP2=2.625評(píng)估預(yù)后不良的敏感度為0.783，特異度為0.714，見(jiàn)圖1。

表3 兩組患者PHLPP1與PHLPP2表達(dá)水平對(duì)比

組別例數(shù)PHLPP1PHLPP2預(yù)后不良72．854±0．8543．052±0．883預(yù)后良好232．011±0．637?1．975±0．447?

注：*與預(yù)后不良相比，P<0.05。

圖1 PHLPP1與PHLPP2表達(dá)水平預(yù)測(cè)預(yù)后不良的ROC曲線

注：PHLPP1表達(dá)水平Area=0.879，P=0.003；PHLPP1表達(dá)水平，Area=0.773，P=0.031。

3 討論

GIST是一類異質(zhì)性腫瘤，大多數(shù)未定向分化，關(guān)于其組織學(xué)起源，有兩種觀點(diǎn)[4]：一種觀點(diǎn)認(rèn)為GIST來(lái)源于胃腸道卡哈爾間質(zhì)細(xì)胞(ICC)，其主要依據(jù)是兩者電鏡下具有相似的超微結(jié)構(gòu)，且均表達(dá)CD117和CD34；另一種觀點(diǎn)認(rèn)為GIST來(lái)源于多潛能間葉干細(xì)胞(mMSC)，其主要依據(jù)是GIST不僅能向ICC分化，同時(shí)也可以向平滑肌分化，且GIST與mMSC均表達(dá)nestin，但I(xiàn)CC幾乎不表達(dá)。其未分化性和組織來(lái)源的復(fù)雜性決定了其生物學(xué)行為的難以預(yù)測(cè)性，這也是GIST臨床治療的主要難點(diǎn)。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院確立的胃腸間質(zhì)瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將胃腸間質(zhì)瘤的侵襲性分為4個(gè)級(jí)別，分別命名為極低危型、低危型、中危型和高危型，臨床調(diào)查結(jié)果顯示[5]，高危型胃腸間質(zhì)瘤術(shù)后5年的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率多數(shù)高于50%。因此，深入挖掘與GIST侵襲性有關(guān)的病理機(jī)制，為其靶向治療提供新思路，仍然是眼下的重要工作方向。

PHLPP是近十幾年發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，其主要作用底物是AKT與蛋白激酶C(PKC)，能夠使兩者去磷酸化從而抑制其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的生物學(xué)作用?，F(xiàn)有研究已證實(shí)[6～8]，在直腸癌、胃癌、肝癌等消化系惡性腫瘤中，以及乳腺癌、卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等其他非消化系惡性腫瘤中，PHLPP1和PHLPP2表達(dá)水平均有明顯下調(diào)，體外研究證實(shí)[9～10]，通過(guò)靶向干預(yù)上調(diào)PHLPP1或PHLPP2表達(dá)，可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增值與侵襲作用。GIST的侵襲行為也是臨床醫(yī)學(xué)面臨的一大難題，但GIST不同于惡性腫瘤，其侵襲行為是否受到PHLPP的調(diào)控尚不得知。本研究發(fā)現(xiàn)，極低危組患的PHLPP1與PHLPP2的表達(dá)水平高于低危組，低危組高于中高危組，任意兩組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果說(shuō)明PHLPP1與PHLPP2均與GIST的侵襲性密切相關(guān)。研究進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)患者的隨訪資料，在1～3年的隨訪期內(nèi)，極低危組無(wú)1例發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡，而中高危組復(fù)發(fā)2例，轉(zhuǎn)移3例，死亡3例，預(yù)后不良發(fā)生率明顯高于極低危組。既往研究指出GIST的侵襲性是決定患者預(yù)后的關(guān)鍵因素[11]，本研究結(jié)果支持該觀點(diǎn)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)預(yù)后不良患者的PHLPP1與PHLPP2表達(dá)水平明顯低于預(yù)后良好者，ROC曲線分析結(jié)果也證實(shí)PHLPP1與PHLPP2表達(dá)水平對(duì)預(yù)后不良均有預(yù)測(cè)價(jià)值，其中PHLPP1=1.810評(píng)估預(yù)后不良的敏感度和特異度分別為0.957和0.714；PHLPP2=2.625評(píng)估預(yù)后不良的敏感度和特異度分別為0.783和0.714。鑒于本組病例數(shù)較少，該數(shù)據(jù)可能存在一定的偏倚性，尚需要大樣本的調(diào)查研究加以驗(yàn)證，但本研究結(jié)果證實(shí)PHLPP1和PHLPP2可能與GIST的侵襲性以及患者預(yù)后均有密切相關(guān)性。

綜上所述，本研究分析30例GIST患者病理組織PHLPP1和PHLPP2表達(dá)水平與臨床數(shù)據(jù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PHLPP1與PHLPP2表達(dá)水平可能與GIST的侵襲行為密切相關(guān)，對(duì)患者預(yù)后具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。

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