MicroRNA-126-5p在阿霉素所致?lián)p傷心肌中的表達及作用*

唐玉婷， 劉艷娟， 童中藝， 李媛彬， 呂青蘭， 孫 慧， 劉炫佑， 劉梅冬， 蔣碧梅， 肖獻忠

(中南大學湘雅醫(yī)學院病理生理學系， 湖南 長沙 410008)

阿霉素(adriamycin；又稱多柔比星，doxorubicin，DOX)是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RNA 和DNA的合成，對RNA的抑制作用最強，抗瘤譜較廣，對多種腫瘤均有抑制作用，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用[1]。目前已有確切研究結(jié)果表明DOX具有時間依賴性和劑量依賴性的心臟毒性[2-3]，即隨著用藥時間的延長和用藥劑量的增大，DOX所致的心肌毒性隨之增大，一旦出現(xiàn)充血性心力衰竭，病死率可高達30%～50%[4]，因此研究阿霉素所致心肌損傷的發(fā)生機制具有非常重要的意義。

微小RNA(microRNA)為一類小分子非編碼RNA，其長度約為18～22個核苷酸。人們最早發(fā)現(xiàn)這類小分子RNA是在1993年，當時這類小分子還未引起足夠的重視；2001年，第2個這樣的小分子let-7被發(fā)現(xiàn)[5],自此，科學家們對microRNA的研究才真正拉開了帷幕。2005年有文獻報道人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了成千種的microRNA[6]。 microRNA可調(diào)節(jié)許多生物學過程，比如細胞增殖、組織分化、細胞凋亡及腫瘤發(fā)生和發(fā)展等[7]。 microRNA-126-5p定位于表皮生長因子樣結(jié)構域7(epidermal growth factor-like domain 7，EGFL7)基因第7號內(nèi)含子[8]。目前研究發(fā)現(xiàn)microRNA-126-5p參與了許多重要的病理生理過程。在乳腺癌中，恢復microRNA-126的功能能抑制腫瘤的生長及細胞的增殖[9]；而且microRNA-126能夠通過抑制sprouty相關含EVH1域蛋白 1(sprouty-related，EVH1 domain-containing protein 1，Spred1)來調(diào)控細胞的增殖以及細胞因子的產(chǎn)生[10]；在惡性間皮瘤中，microRNA-126通過調(diào)節(jié)細胞的代謝來誘導自噬[11]。文獻顯示，microRNA-126-5p在心血管系統(tǒng)中具有特異性表達，參與血管內(nèi)皮細胞炎癥性損傷與修復過程，進而在血管形成方面起著非常重要的作用，因而與高血壓[12]、動脈粥樣硬化[13]、冠心病[14]和心力衰竭[15]等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。但microRNA-126-5p是否參與了DOX所致心肌損傷，目前尚不清楚。

本科室前期研究工作采用microRNA芯片發(fā)現(xiàn)microRNA-126-5p在心肌缺血-再灌注損傷模型中表達有差異[16]，提示microRNA-126-5p可能在心肌損傷中發(fā)揮某種作用。MicroRNA-126-5p是否在阿霉素所致的心肌損傷中起作用呢？基于以上猜想，本實驗采用BABL/c小鼠腹腔注射阿霉素制備心肌損傷模型，提取心肌組織RNA，進而運用real-time PCR檢測小鼠中microRNA-126-5p的表達情況，并從細胞水平探討microRNA-126-5p在阿霉素損傷的心肌細胞中的表達及其作用。

材 料 和 方 法

1 動物和細胞

18～22 g左右的BALB/c雄性小鼠購自于長沙斯萊克景達實驗動物有限公司。大鼠心肌細胞株H9c2購自于美國標準生物品收藏中心。

2 主要試劑

MicroRNA引物購于GeneCopoeia；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及PCR試劑盒購自于TaKaRa；microRNA-126-5p的模擬物(mimic)和抑制物(inhibitor)以及相關的轉(zhuǎn)染試劑HiPerFect Transfection Reagent 購自Qiagen。

3 主要方法

3.1阿霉素所致小鼠心肌損傷模型的構建 實驗分為慢性DOX(chronic DOX, C-DOX)組、急性DOX(acute DOX, A-DOX)組、慢性生理鹽水(chronic NS, C-NS)組和急性生理鹽水(acute NS, A-NS)組。慢性DOX組小鼠按5 mg/kg的劑量每周腹腔注射DOX(溶于生理鹽水中)溶液，而慢性生理鹽水組則注射相同體積的生理鹽水，均連續(xù)注射4周(總共劑量為20 mg/kg)。到第5周動物模型制備完成時取材。急性DOX組則從第1天起按4 mg/kg的劑量腹腔每天注射一次DOX溶液，連續(xù)注射5次(共 5 d，總劑量為20 mg/kg)，同樣急性生理鹽水組也按此方法每天注射相同體積的生理鹽水。到第6天動物模型制備完成時取材。

3.2蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色觀察小鼠心肌形態(tài)學的改變 將上述心肌組織置于4%的多聚甲醛中固定24 h后脫水，石蠟包埋，切片4 ℃冰箱長期保存。將實驗用切片置于60 ℃烤箱中烘烤1 h，之后脫水脫蠟，最后再用蘇木素伊紅染色，顯微鏡下觀察心肌受損情況。

3.3血清中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)的測定 操作步驟按LDH檢測試劑盒說明書操作。

3.4心肌血流動力學指標的測定 小鼠心肌損傷模型制備完成后開始取材，將小鼠按2.5 mL/kg的劑量用5%的水合氯醛麻醉，置于實驗臺上仰臥固定，行氣管插管術，連接小動物呼吸機保證小鼠呼吸通暢。75%乙醇消毒小鼠胸部毛發(fā)后沿著第3、4肋間打開小鼠胸腔，露出心尖，將注射器6號針頭磨鈍后用2.5×105U/L肝素生理溶液排盡針頭中的空氣，并用此肝素生理溶液充滿該針頭后與血流動力學分析探頭進行連接，排盡空氣，避免氣泡的出現(xiàn)，以免血液凝固堵塞管道。待一切準備工作完成以后，將磨鈍的針頭從心尖插入左心室，測量心率等相關指標。之后再通過PowerLab System分析血流動力學的相關指標：左心室等容舒張期壓力下降最大速率(-dp/dtmax)和左心室等容收縮期壓力上升最大速率(+dp/dtmax)。

3.5Real-time PCR法檢測損傷心肌中microRNA-126-5p的表達 從-80 ℃中取出已收集好的心肌組織標本，用Trizol提取組織中RNA。Trizol法提取組織RNA步驟為：將標本從-80 ℃取出后迅速放入液氮中速凍，用經(jīng)過高溫滅酶的研缽研磨至成粉末狀后再轉(zhuǎn)移至無酶EP管中。每個標本加入1 mL Trizol裂解組織，室溫放置2～5 min。加入0.2 mL的三氯甲烷(按1/5體積)，上下倒置混勻15 s，充分混勻后靜置10 min，于4 ℃冷室中以12 000 r/min離心15 min。輕輕吸取上清液至另一1.5 mL無酶EP管中，加入同體積的異丙醇，上下倒置混勻15 s，靜置10 min，于4 ℃冷室中以12 000 r/min離心10 min。倒掉上清液(注意不要倒掉管壁上的白色絮狀沉淀)，加入1 mL的75%的乙醇洗滌沉淀(置于4 ℃冷室中以7 500 r/min離心5 min)。加入20 μL無酶水溶解沉淀，必要時可置55 ℃水浴鍋中助溶)。

3.6MicroRNA-126-5p mimic與inhibitor的轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染按照Qiagen公司的HiPerFect Transfection Reagent使用說明書進行操作，首先往24孔板中接種H9c2細胞，每個孔中加入500 μL的培基，待細胞長至融合度為60%時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前先將0.15 μL microRNA mimic或1.5 μL inhibitor加入100 μL無血清培養(yǎng)基中，混勻后再加入3 μL的HiPerFect Transfection Reagent，充分混勻，室溫孵育5～10 min，再逐滴加入孔中，輕輕振蕩混勻。最后再將24孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～72 h后采用real-time PCR觀察轉(zhuǎn)染效果。

3.7Caspase-3 活性的檢測 操作步驟按照碧云天的caspase-3活性檢測試劑盒的說明書進行。Caspase-3通過催化底物Ac-DEVD-pNA產(chǎn)生黃色的pNA產(chǎn)物，從而測量pNA在405 nm處的吸光度來測定caspase-3的活性(pNA在405 nm左右有強的吸光度)。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組之間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 microRNA-126-5p在DOX損傷的小鼠心肌組織中的表達情況

HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)急性DOX組小鼠肌纖維排列紊亂，肌原纖維溶解，并且局部伴有炎癥細胞浸潤，此種情形在慢性DOX組中表現(xiàn)尤為明顯，見圖1A。收集小鼠的血清，采用LDH試劑盒檢測小鼠血清中LDH活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與生理鹽水組相比，急、慢性DOX組血清LDH水平均明顯升高(P<0.05)，見圖1B。用Powerlab System檢測小鼠血流動力學相關指標，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與生理鹽水組相比，急、慢性DOX組的-dp/dtmax和+dp/dtmax均明顯降低，而急性生理鹽水組與慢性生理鹽水組相比較差異則無統(tǒng)計學顯著性，見圖1C。上述結(jié)果提示DOX處理可導致心肌受損，心臟功能下降。

用real-time PCR法檢測心臟組織中microRNA-126-5p的表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與生理鹽水對照組相比，急、慢性DOX組microRNA-126-5p的表達量均明顯升高(P<0.05)，見圖1D。

2 DOX損傷的心肌細胞中microRNA-126-5p的表達

用real-time PCR法檢測DOX損傷的H9c2細胞中microRNA-126-5p的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著DOX濃度的增加及作用時間的延長，microRNA-126-5p的表達均明顯上調(diào)(P<0.05)，與動物整體實驗的表達水平相似，見圖2。

3 microRNA-126-5p mimic 對DOX所致心肌細胞損傷的影響

為了探討在心肌細胞損傷模型中，microRNA-126-5p表達上調(diào)是伴隨現(xiàn)象，還是其它某種作用，我們采用了DOX所致心肌細胞損傷模型，并轉(zhuǎn)染microRNA-126-5p mimic來探討其作用。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了microRNA-126-5p mimic 24 h后microRNA-126-5p的表達水平明顯升高(P<0.05)，而mimic陰性對照組與空白組相比差異則無統(tǒng)計學顯著性，見圖3A。

接著我們將轉(zhuǎn)染了microRNA-126-5p mimic 24 h后的H9c2細胞再用DOX刺激，收集蛋白檢測caspase-3的水平，收集細胞培養(yǎng)液檢測LDH的釋放，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用DOX刺激后細胞培養(yǎng)液中LDH的釋放明顯增加，caspase-3的活性明顯增強(均P<0.05)；而microRNA-126-5p mimic +DOX組LDH的釋放和caspase-3的活性進一步增加(P<0.05)，提示microRNA-126-5p mimic可促進DOX所致心肌細胞損傷，見圖3B、C。

Figure 1. The expression levels of microRNA-126-5p in myocardial tissues injured by DOX. A: HE staining was applied to detect the morphological changes of myocardial tissues; B: the detection of LDH in serum (n=6); C: the effect of DOX on ±dp/dtmax(n=6); D: the expression of microRNA-126-5p (n=5). Mean±SD.*P<0.05vsC-NS group;#P<0.05vsA-NS group.

圖1microRNA-126-5p在DOX損傷的心肌組織中的表達水平

Figure 2. The expression of microRNA-126-5p in the H9c2 cells treated with DOX. A: H9c2 cells were treated with DOX at different concentrations for 24 h; B: H9c2 cells were treated with DOX at 0.5 mg/L for different time. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L group;#P<0.05vs0 h group.

圖2microRNA-126-5p在DOX損傷的心肌細胞中表達水平的變化

4 microRNA-126-5p inhibitor 對DOX所致心肌細胞損傷的影響

為了進一步探討microRNA-126-5p在心肌細胞損傷中的作用，我們采用了microRNA-126-5p inhibitor作用于細胞，從所得結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了microRNA-126-5p inhibitor后，microRNA-126-5p的表達水平明顯降低(P<0.05)，而inhibitor的陰性對照組與空白組相比差異則無統(tǒng)計學顯著性，見圖4A。

接著我們將轉(zhuǎn)染microRNA-126-5p inhibitor 24 h后的H9c2細胞再用DOX 刺激，收集細胞培養(yǎng)液檢測LDH的釋放，收集蛋白檢測caspase-3的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用DOX刺激后細胞培養(yǎng)液中LDH的釋放明顯增加，caspase-3的活性明顯增強(均P<0.05)；而轉(zhuǎn)染microRNA-126-5p inhibitor可抑制LDH的釋放及caspase-3的活性(P<0.05)，提示microRNA-126-5p inhibitor可抑制DOX所致心肌細胞損傷，具有心肌細胞保護作用，見圖4B、C。

Figure 3. The effect of microRNA-126-5p mimic on myocardial cell injury induced by DOX. A: real-time PCR was applied to detect the expression of microRNA-126-5p in the H9c2 cells transfected with microRNA-126-5p mimic (n=6); B: the effect of microRNA-126-5p mimic on caspase-3 activity in DOX-treated H9c2 cells (n=3); C: the effect of microRNA-126-5p mi-mic on LDH release in DOX-treated H9c2 cells (n=3). MM: microRNA-126-5p mimic； MC: mimic control. Mean±SD.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDOX group.

圖3microRNA-126-5pmimic在DOX誘導的心肌細胞損傷中的作用

Figure 4. The effect of microRNA-126-5p inhibitor on myocardial cell injury induced by DOX. A: real-time PCR was applied to detect the expression of microRNA-126-5p in the H9c2 cells transfected with microRNA-126-5p inhibitor (n=6); B: the effect of microRNA-126-5p inhibitor on LDH release in DOX-treated H9c2 cells (n=3); C: the effect of microRNA-126-5p inhibitor on caspase-3 activity in DOX-treated H9c2 cells (n=3). MI: microRNA-126-5p inhibitor； IC: inhibitor control. Mean±SD.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDOX group.

圖4microRNA-126-5pinhibitor在DOX誘導的心肌損傷中的作用

討 論

DOX是廣譜抗腫瘤藥，可直接嵌入DNA而抑制核酸的合成，對多種腫瘤具有很好的抑制性。臨床上廣泛用于治療急性淋巴細胞白血病和急性粒細胞性白血病等。雖然它在臨床上被廣泛使用，然而其副作用不容忽視。DOX的急性副反應主要有嘔吐、惡心以及心律不齊等。目前已有確切的研究結(jié)果表明DOX用于抗腫瘤治療的同時可引起心臟毒性。長期大量使用DOX后，DOX可在線粒體氧化磷酸化作用下與Fe2+相互作用產(chǎn)生大量活性氧簇，導致心肌損傷，進而造成肌原纖維凋亡[17]。從目前研究結(jié)果來看DOX導致的心肌損傷的機制有很多，比如說代謝機制、DNA損傷和氧化應激等，有研究表明DOX能夠通過內(nèi)源性和外源性機制來引起心肌細胞的凋亡，致使caspase-3、6和7被激活，促進心肌細胞的凋亡[18]。

microRNA-126-5p可以抑制蛋白質(zhì)的翻譯或直接降解其靶mRNA來調(diào)控蛋白質(zhì)的表達進而發(fā)揮其生物學效應。體內(nèi)外研究表明，microRNA-126-5p在維持血管完整性和促進血管新生中起重要作用，促血管新生的作用一部分與抑制蛋白Spred-1的表達有關[19]。調(diào)查顯示，在穩(wěn)定性心絞痛中，microRNA-126-5p是一個顯示冠狀動脈性疾病的復雜性與嚴重性的潛在指標[20]。我們實驗室前期研究也發(fā)現(xiàn)，缺血-再灌注損傷心肌中microRNA-126-5p表達上調(diào)[16]，這些結(jié)果提示microRNA-126-5p可能在心肌損傷與保護中發(fā)揮某種作用。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹腔注射DOX后，小鼠心肌出現(xiàn)形態(tài)學改變，用PowerLab System檢測發(fā)現(xiàn)小鼠左室心功能降低，血清酶學檢測小鼠血清中LDH釋放增加，這一系列指標皆表明DOX確實可以誘導心肌損傷。進一步采用real-time PCR法檢測檢測發(fā)現(xiàn)小鼠心肌中的microRNA-126-5p表達水平在DOX所致心肌損傷模型中明顯上升，這表明microRNA-126-5p可能在DOX誘導的心肌損傷中發(fā)揮著某種作用。

為了進一步探討microRNA-126-5p在DOX誘導的心肌損傷中的作用，我們采用DOX誘導心肌細胞損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)microRNA-126-5p mimic可使心肌細胞中microRNA-126-5p表達升高，促進細胞凋亡，而microRNA-126-5p inhibitor可使心肌細胞中microRNA-126-5p表達下調(diào)，抑制心肌細胞凋亡，具有心肌細胞保護作用。但microRNA-126-5p具體是通過何種機制在DOX誘導的心肌損傷中起作用的呢？我們通過生物信息學軟件預測了microRNA-126-5p可能調(diào)控的靶基因，如Hspb8。但它是否通過調(diào)控這些蛋白質(zhì)的表達而發(fā)揮作用，尚需進一步研究。

[參考文獻]

[1] 陳奇彪, 詹雄宇, 呂秀秀, 等. 小檗堿增強阿霉素誘導的膀胱癌T24細胞凋亡[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(5):847-851.

[2] Wu R, Wang HL, Yu HL, et al. Doxorubicin toxicity changes myocardial energy metabolism in rats[J]. Chem Biol Interact, 2016, 244:149-158.

[3] 唐春梅, 張 銘, 胡志琴, 等. MicroRNA-34a靶向SIRT1參與阿霉素誘導的心肌細胞凋亡[J]. 中國病理生理雜志, 2017, 33(3):385-391.

[4] Gu J, Hu W, Zhang DD. Resveratrol, a polyphenol phytoalexin, protects against doxorubicin-induced cardiotoxicity[J]. J Cell Mol Med, 2015, 19(10): 2324-2328.

[5] Almeida MI, Reis RM, Calin GA. MicroRNA history: discovery, recent applications, and next frontiers[J]. Mutation Res, 2011, 717(1-2):1-8.

[6] Bentwich I, Avniel A, Karov Y, et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human micro-RNAs[J]. Nat Gene, 2005, 37(7): 766-770.

[7] Kontomanolis EN, Koukourakis MI. MicroRNA: the potential regulator of endometrial carcinogenesis[J]. MicroRNA, 2015, 4(1):18-25.

[8] Liu B, Peng XC, Zheng XL, et al. MiR-126 restoration down-regulate VEGF and inhibit the growth of lung cancer cell lines in vitro and in vivo[J]. Lung Cancer, 2009, 66(2):169-175.

[9] Tavazoie SF, Alarcon C, Oskarsson T, et al. Endogenous human microRNAs that suppress breast cancer metastasis[J]. Nature, 2008, 451(7175):147-152.

[10] Ishizaki T, Tamiya T, Taniguchi K, et al. miR126 positively regulates mast cell proliferation and cytokine production through suppressing Spred1[J]. Genes Cells, 2011, 16(7): 803-814.

[11] Tomasetti M, Monaco F, Manzella N, et al. MicroRNA-126 induces autophagy by altering cell metabolism in malignant mesothelioma[J]. Oncotarget, 2016, 7(24): 36338-36352.

[12] Potus F, Malenfant S, Graydon C, et al. Impaired angiogenesis and peripheral muscle microcirculation loss contribute to exercise intolerance in pulmonary arterial hypertension[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2014, 190(3):318-328.

[13] Kim JM, Jung KH, Chu K, et al. Atherosclerosis-related circulating microRNAs as a predictor of stroke recurrence[J]. Transl Stroke Res, 2015, 6(3):191-197.

[14] Zhang J, Zhang Z, Zhang DY, et al. microRNA 126 inhibits the transition of endothelial progenitor cells to me-senchymal cells via the PIK3R2-PI3K/Akt signalling pathway[J]. PLoS One, 2013, 8(12):e83294.

[15] Qiang L, Hong L, Ningfu W, et al. Expression of miR-126 and miR-508-5p in endothelial progenitor cells is associated with the prognosis of chronic heart failure patients[J]. Int J Cardiol, 2013, 168(3):2082-2088.

[16] Jiang B, Liu Y, Liang P, et al. MicroRNA-126a-5p enhances myocardial ischemia-reperfusion injury through suppressing Hspb8 expression[J]. Oncotarget, 2017， 8(55):94172-94187.

[17] Bolli R, Becker L, Gross G, et al. Myocardial protection at a crossroads: the need for translation into clinical therapy[J]. Circ Res, 2004, 95(2):125-134.

[18] Gianni M, Studer M, Carpani G, et al. Retinoic acid induces liver/bone/kidney-type alkaline phosphatase gene expression in F9 teratocarcinoma cells[J]. Biochem J, 1991, 274(Pt 3):673-678.

[19] Zhang Q, Kandic I, Kutryk MJ. Dysregulation of angiogenesis-related microRNAs in endothelial progenitor cells from patients with coronary artery disease[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 405(1):42-46.

[20] Li HY, Zhao X, Liu YZ, et al. Plasma microRNA-126-5p is associated with the complexity and severity of coronary artery disease in patients with stable angina pectoris[J]. Cell Physiol Biochem, 2016, 39(3):837-846.