人腦膠質(zhì)瘤IDH1基因突變與臨床病理類別的關(guān)系

譚國偉 陳曦 孫金莉 陳四方 郭劍峰 王占祥

腦膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)腫瘤，腫瘤生長迅速，與正常腦組織無明確邊界，治療效果不佳，復(fù)發(fā)率、病殘率、死亡率較高[1]。近期研究顯示，膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)異檸檬酸脫氫酶 1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）基因存在突變情況，且IDH1基因突變與膠質(zhì)瘤的發(fā)生及發(fā)展有著重要聯(lián)系，對膠質(zhì)瘤患者的診治有積極意義[2]。有鑒于此，本研究選取廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科自2014年1月至2017年9月收治并實施手術(shù)的膠質(zhì)瘤患者76例，通過免疫組化檢測并鑒定各病理組織樣本中IDH1基因突變情況，總結(jié)報告如下。

資料與方法

一、臨床資料

膠質(zhì)瘤患者76例，男性45例，女性31例；年齡為19～67歲，平均（40.7±9.3）歲。按照膠質(zhì)瘤的病理類型及WHO級別分為毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤（WHOⅠ級）3例，彌漫性星形細(xì)胞瘤（WHOⅡ級）14例，少突膠質(zhì)瘤 （WHOⅡ級）3例，少突星形細(xì)胞瘤（WHO Ⅱ級）6例，室管膜瘤（WHO Ⅱ級）4例，節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤 （WHOⅡ級）2例，間變型星形細(xì)胞瘤（WHOⅢ級）11例，間變型少突星形細(xì)胞瘤（WHOⅢ級）7例，多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 （WHOⅣ級）26例。所有患者術(shù)前均未接受任何放、化療等干預(yù)措施。此項臨床研究得到廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

二、免疫組化

檢測mIDH1 R32H在胞質(zhì)中的表達(dá)，以推斷IDH1基因突變情況。取術(shù)中切除的腫瘤組織行常規(guī)石蠟包埋及切片。將石蠟切片置于60℃恒溫箱中烘烤2 h后予以脫蠟和水化，加入0.01 mol/L枸櫞酸行抗原熱修復(fù) 2 min，3%H2O2避光37℃恒溫孵育15 min后用 0.3%Triton-磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）冰上破膜5 min，山羊血清37℃封閉45 min，添加mIDH1 R132H單克隆抗體（Dianova，1∶20 稀釋），4℃孵育過夜。 辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗反應(yīng)液（武漢谷歌）室溫孵育60 min后，滴加新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺顯色液并水洗終止，蘇木素復(fù)染3 min后轉(zhuǎn)入1%鹽酸酒精分化并以淡氨水返藍(lán)，梯度脫水透明后以中性樹脂封片，光鏡下觀察。根據(jù)染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞百分比2項指標(biāo)判定每例病理組織樣本中IDH1基因突變情況。切片染色強(qiáng)度評分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。陽性細(xì)胞百分比評分：0分為陰性，1分為陽性細(xì)胞≤10%，2分為陽性細(xì)胞11%～50%，3分為陽性細(xì)胞 51%～75%，4分為陽性細(xì)胞>75%。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積>3分判定為IDH1基因突變陽性，該樣本判定為IDH1突變型病例；染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積≤3分判定為IDH1基因突變陰性，該樣本判定為IDH1野生型病例。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本均數(shù)差別行t檢驗，兩樣本突變率差別行χ2檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各種病理類型膠質(zhì)瘤標(biāo)本IDH1基因突變情況

全組76例膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，檢出IDH1基因突變37例，總體突變率為48.68%。各種病理類型突變率由高至低分別為：彌漫性星形細(xì)胞瘤（71.43%）、間變型少突星形細(xì)胞瘤（71.43%）、少突膠質(zhì)瘤（66.67%）、少突星形細(xì)胞瘤 （66.67%）、間變型星形細(xì)胞瘤（63.64%）、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（34.62%）、毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤（0%）、室管膜瘤（0%）、節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤（0%）。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤這一病理類型中，原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤IDH1突變率較低（8.33%），而繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤IDH1突變率較高（57.14%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。詳細(xì)信息見表1～2。

二、各種病理類型膠質(zhì)瘤標(biāo)本IDH1突變情況對應(yīng)患者年齡分布

全組76例膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，IDH1基因突變型患者平均年齡為（35.9±5.5）歲，野生型為（45.2±10.0）歲，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。其中，彌漫性星形細(xì)胞瘤、少突星形細(xì)胞瘤、間變型星形細(xì)胞瘤、間變型少突星形細(xì)胞瘤及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中，IDH1基因突變型患者平均年齡均低于野生型患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤這一病理類型中，原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者平均年齡[（53.0±7.5）歲]高于而繼發(fā)性[（44.4±5.6）歲]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。詳細(xì)信息見表1。

討 論

IDH1是人染色體2q33.3上的IDH1基因所編碼翻譯的一種蛋白酶，存在于細(xì)胞質(zhì)和過氧化物酶體中，可經(jīng)同源二聚體形式成為一個功能單位[1]。IDH1催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸（α-Ketoglutarate，α-KG），對于維持細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)大量雙加氧酶的活性是必需的；同時將NAD(P)+作為電子和氫受體轉(zhuǎn)化生成NADPH，為脂質(zhì)生物合成提供關(guān)鍵的還原當(dāng)量，同時，NADPH還是極其重要的抗氧化劑，用以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激以及放射性損害[2]。IDH1基因突變是膠質(zhì)瘤細(xì)胞中IDH突變的主要類型，約為80%～90%[3]。最常見的IDH1基因突變類型為132位的精氨酸取代組氨酸（R132H），約占所有IDH1突變類型的90%，其他較為少見的突變類型分別為R132C、R132G、R132S[4]。有研究表明，IDH1R32H突變基因不僅減少了IDH1蛋白酶的分泌，同時降低了該酶的活性，使得胞內(nèi)細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子-1α含量增加，α-KG合成減少，最終促進(jìn)腫瘤的生長及增殖，因此認(rèn)為IDH1具有腫瘤抑制因子的作用[5,6]。Yan等[7]的研究證實，IDH1突變可使多數(shù)基因啟動子CpG島超甲基化，干擾正常的細(xì)胞分化，導(dǎo)致未成熟細(xì)胞的增殖效應(yīng)。但目前上述觀點仍存在爭議。

表1 各種病理類型膠質(zhì)瘤標(biāo)本IDH1基因突變情況及年齡分布

表2 原發(fā)及繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本IDH1基因突變率

最新研究顯示，IDH1基因的突變與膠質(zhì)瘤的發(fā)生及發(fā)展有重要聯(lián)系。Turcan等[8]的研究表明，IDH突變多發(fā)生于膠質(zhì)瘤形成的早期，若IDH突變后發(fā)生P53及ATRX基因突變，腫瘤即向星型細(xì)胞瘤方向發(fā)展；若IDH突變后發(fā)生1p/19q共缺失，腫瘤則向少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤方向發(fā)展。另外，IDH1基因突變較常見于年輕患者以及彌漫性低級別膠質(zhì)瘤、繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者；原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中，IDH1突變率<5%[8]。而Dimitrov等[9]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IDH突變患者擁有較長的總體生存期及無進(jìn)展生存期[9]。王國良等[10]的研究顯示，IDH1R132H突變基因能夠協(xié)同增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞對TMZ藥物的敏感性，同時具有促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用。上述研究表明，IDH1基因突變普遍存在于膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，并與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后、耐藥性等生物學(xué)特性密切相關(guān)。

有鑒于此，本研究使用德國Dianova公司生產(chǎn)的mIDH1R132H單克隆抗體，對膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本進(jìn)行IDH1基因突變檢測，檢測效果良好。全組76例膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，共檢出IDH1基因突變37例，總體突變率為 48.68%。與 Chen等[11]、Lopci等[12]的結(jié)果類似，低于Opoku-Darko等[13]的統(tǒng)計結(jié)果。IDH1突變主要見于彌漫性星形細(xì)胞瘤（71.43%）、間變型少突星形細(xì)胞瘤（71.43%）、少突膠質(zhì)瘤（66.67%）、少突星形細(xì)胞瘤（66.67%）、間變型星形細(xì)胞瘤（63.64%）等病理類型。但室管膜瘤（WHOⅡ級）及節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤（WHOⅡ級）中未出現(xiàn)IDH1基因突變，提示室管膜瘤及節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤可能與上述IDH1突變高發(fā)的病理類型存在不同的發(fā)生起源及分子病理機(jī)制。本研究顯示，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中IDH1總體突變率為34.62%，其中，原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤IDH1突變率較低，僅為8.33%，而繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤IDH1突變率較高，達(dá)57.14%，存在統(tǒng)計學(xué)差異，接近Gessler等[14]的統(tǒng)計結(jié)果。若按照神經(jīng)病理WHO分級統(tǒng)計，WHOⅠ級膠質(zhì)瘤IDH1基因突變率為0%，Ⅱ級為55.17%，Ⅲ級為66.67%，Ⅳ級為34.62%，提示IDH1基因突變主要見于WHOⅡ～Ⅲ級膠質(zhì)瘤，近似于Yang等[15]的結(jié)果。本組病例同時提示，IDH1基因突變型患者的平均年齡[（35.9±5.5）歲]明顯低于野生型患者[（45.2±10.0）歲]，存在統(tǒng)計學(xué)意義，與國外文獻(xiàn)報道結(jié)果一致[2,8,9]。

目前對于IDH1基因的抑癌作用、IDH1突變對腫瘤生物學(xué)特性的影響尚無最終定論，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。受限于病例數(shù)量以及研究手段，本研究不足以完整呈現(xiàn)膠質(zhì)瘤患者中IDH1基因突變情況，有待后續(xù)大宗病例分析及多中心協(xié)作進(jìn)一步探究，并通過長期隨訪結(jié)果，進(jìn)一步明確IDH1基因突變與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展、治療、預(yù)后之間的相互關(guān)系，為膠質(zhì)瘤的綜合及個體化治療提供參考及指導(dǎo)。

[1] Turkalp Z,Karamchandani J,Das S.IDH mutation in glioma:new insights and promises for the future[J].JAMA Neurol,2014,71(10):1319-1325.

[2] Eckel-Passow JE,Lachance DH,Molinaro AM,et al.Glioma Groups Based on 1p/19q,IDH,and TERT Promoter Mutations in Tumors[J].N Engl J Med,2015,372(26):2499-508.

[3] Pesenti C,Paganini L,Fontana L,et al.Mass spectrometry-based assay for the molecular diagnosis of glioma:concomitant detection of chromosome 1p/19q codeletion,and IDH1,IDH2,and TERT mutation status[J].Oncotarget,2017,8(34):57134-57148.

[4] Mu L,Xu W,Li Q,et al.IDH1 R132H mutation is accompanied with malignant progression of paired primary-recurrent astrocytic tumours[J].J Cancer,2017,8(14):2704-2712.

[5] Zhao S,Lin Y,Xu W,et al.Glioma-derived mutations in IDH1 dominantly inhibit IDH1 catalytic activity and induce HIF-1alpha[J].Science,2009,324(5924):261-265.

[6] Yalaza C,Ak H,Cagli MS,et al.R132H Mutation in IDH1 Gene is associated with increased tumor HIF1-alpha and serum VEGF levels in primary glioblastoma multiforme[J].Ann Clin Lab Sci,2017,47(3):362-364.

[7] Yan H,Parsons DW,Jin G,et al.IDH1 and IDH2 mutations in gliomas[J].N Engl J Med,2009,360(8):765-773.

[8] Turcan S,Rohle D,Goenka A,et al.IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype[J].Nature,2012,483(7390):479-483.

[9] Dimitrov L,Hong CS,Yang C,et al.New developments in the pathogenesis and therapeutic targeting of the IDH1 mutation in glioma[J].Int J Med Sci,2015,12(3):201-213.

[10] 王國良,賽克,公方和,等.異檸檬酸脫氫酶1基因突變增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞對替莫唑胺的敏感性[J].中國臨床神經(jīng)外科雜志,2014,19(2):95-98.

[11] Chen N,Yu T,Gong J,et al.IDH1/2 gene hotspot mutations in central nervous system tumours:analysis of 922 Chinese patients[J].Pathology,2016,48(7):675-683.

[12] Lopci E,Riva M,Olivari L,et al.Prognostic value of molecular and imaging biomarkers in patients with supratentorial glioma[J].Eur J Nucl Med Mol Imaging,2017,44(7):1155-1164.

[13] Opoku-Darko M,Lang ST,Artindale J,etal.Surgical management of incidentally discovered diffusely infiltrating lowgrade glioma[J].J Neurosurg,2017,Epub ahead of print.

[14] Gessler F,Zappi J,Konczalla J,et al.Secondary glioblastoma:molecular and clinical factors that affect outcome after malignant progression of a lower grade tumor[J].World Neurosurg,2017,102:49-55.

[15] Yang Y,Mao Q,Wang X,et al.An analysis of 170 glioma patients and systematic review to investigate the association between IDH-1 mutations and preoperative glioma-related epilepsy[J].J Clin Neurosci,2016,31:56-62.